骨瓜提取物对大鼠类风湿关节炎HA、IL-1β、BMPs及MMP-1的影响

钞　艳，赵凌艳，颜　梅，郭俐宏，吴胜英

骨瓜提取物对大鼠类风湿关节炎HA、IL-1β、BMPs及MMP-1的影响

钞艳1，赵凌艳1，颜梅1，郭俐宏1，吴胜英2*

[摘要]目的观察骨瓜提取物注射液对大鼠类风湿关节炎关节滑膜骨形态发生蛋白(BMPs)、软骨细胞MMP-1阳性表达及关节积液透明质酸(HA)、白细胞介素-1β亚型(IL-1β)的影响，探讨其作用机制。方法大鼠40只，随机分为空白对照组、模型组、骨瓜小剂量组及骨瓜大剂量组，分别于模型组、骨瓜小剂量组、骨瓜大剂量组大鼠右膝关节腔内多点注射小牛软骨Ⅱ型胶原加福氏完全佐剂0.1 mL，制备类风湿性关节炎动物模型，造模成功后，骨瓜小剂量组、骨瓜大剂量组分别用骨瓜提取物注射液肌注治疗21 d，于治疗第1、7、14、21天，分别测定四组大鼠关节积液中HA及IL-1β含量；检测滑膜BMPs及MMP-1阳性表达，测量右足趾关节以下部位的容积并计算足肿胀度，记录各组动物消肿时间，评价骨瓜提取物注射液对大鼠类风湿性关节炎的治疗效果。结果治疗下14、21 d时，骨瓜小剂量组、骨瓜大剂量组MMP-1阳性表达及关节积液中IL-1β明显降低，BMPs及HA含量明显升高，消肿时间缩短，足肿胀度明显优于模型组，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，骨瓜小剂量组、骨瓜大剂量组间各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论骨瓜提取物注射液可促进类风湿关节炎模型大鼠关节积液HA及BMPs分泌与合成，降低软骨细胞MMP-1阳性表达，抑制炎性介质IL-1β对关节滑膜的侵蚀而起到保护关节的作用。

[关键词]骨瓜提取物注射液；类风湿性关节炎；软骨细胞MMP-1；IL-1β；骨形态发生蛋白；透明质酸

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of bone melon extract injection on synovial bone morphogenetic protein (BMPs),effusion of cartilage cells MMP-1 positive expression and articular hyaluronic acid (HA),interleukin-1β (IL-1β)of rats with rheumatoid arthritis,and to explore its mechanism.MethodsForty rats were selected and randomized into control group,modern group,low-dose and high-dose bone melon extract group,the rheumatoid arthritis model was established by injection of bovine type Ⅱ collagen,the rats treated with bovine type Ⅱ collagen were in jected with bone melon low/high dose for 21 d.Interleukin-1β (IL-1β) in knee joint was measured by ELISA,hyaluronic acid (HA) content were measured by biochemistry,BMPs and MMP-1 in knee joint were measured.The volume of right knee art and below parts was measured and the percentage of swelling was calculated.Swelling time was recorded and animal treatment effect was evaluated at 1,7,14,21 d after operation.ResultsThe expression levels of IL-1β and MMP-1 decreased significantly,BMPs and HA content increased obviously of low-dose and high-dose bone melon extract group at 7,14,21 d after operation,swelling time was shortened,and the swelling degree was significantly better than that of model group (P<0.05).Low-dose and high-dose bone melon extract group had no significant difference.ConclusionBone melon extract can promote the secretion and synthesis of cartilage cells of HA and BMPs in joint effusion of rheumatoid arthritis rats,and reduce the positive expression of MMP-1,inhibit inflammatory mediators IL-1β on erosion immersed synovial joints and achieve the therapeutic effect.

收稿日期：2015-06-24

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512012

Effects of bone melon extract on HA,IL-1β,BMPs and MMP-1 of rats with rheumatoid arthritisCHAO Yan1,ZHAO Ling-yan1,YAN Mei1,GUO Li-hong1,WU Sheng-ying2*(1.Department of Endocrinology,Shiyan Taihe Hospital Affiliated to Hubei Medical College,Shiyan 442000,China;2.Department of Pathophysiology,Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

Key words：Bone melon extract injection;Rheumatoid arthritis;Cartilage cell MMP-1;IL-1β;Bone morphogenetic protein;Hyaluronic acid

0引言

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一类原因不明，好发于四肢关节、心脏等器官的自身免疫性疾病，临床病理改变以四肢关节滑膜慢性炎症为主，常累及关节软骨滑膜及骨质[1]。其病因主要为软骨的破坏与变性，是软骨分解与合成代谢失衡的结果[2]，此类疾病多发于中年以后的慢性、退行性关节疾病，膝关节腔伴有大量积液为多见，临床以四肢(膝关节为甚)疼痛、变形和活动受限为特点。临床特征为关节结构的炎症和肿胀、慢性进行性病程，并可致多个关节完全强直，骨质疏松及关节畸形，并最终导致关节功能的丧失，目前尚无理想的治疗办法。中医认为，膝骨性关节炎属“痹证”，“风、寒、湿”合而成痹，此类患者常挟湿气下注于关节[3]。由于软骨分解及合成代谢失衡及筋络脉隧痹阻不通，多继发滑膜与滑液炎，其病理改变多以膝关节滑膜受损及关节腔积液为主[4]，本实验采取骨瓜提取物注射液治疗弗氏完全佐剂性大鼠类风湿关节炎，旨在挖掘祖国中医药治疗关节炎的优势，探讨其作用机制，为临床用药提供理论依据。

1材料和方法

1.1实验动物Wistar大鼠40只，雌雄兼用，体重(250±50)g，实验动物由湖北医药学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK(鄂)2011-0008；实验动物设施使用许可证：SYXK(鄂)2011-0031。二级洁净动物房饲养，每笼1只，自由饮水，每日给予由动物中心配置的标准饲料。

1.2药品与试剂骨瓜提取物注射液(哈尔滨圣泰生物制药有限公司，批准文号：国药准字H23023507)；小牛软骨Ⅱ型胶原加福氏完全佐剂(上海实生细胞生物技术有限公司)。

1.3急性关节炎模型制备参照文献[5]，碘伏浸泡大鼠右足趾消毒，模型组、骨瓜小剂量组及骨瓜大剂量组大鼠于右膝关节腔内注射小牛软骨Ⅱ型胶原加福氏完全佐剂0.1 mL，对照组注射等量生理盐水，每日强迫动物活动30 min，14 d后出现以下与临床急性膝关节炎表现一致的症状即可确定大鼠急性膝关节炎模型造模成功：①关节及其周围僵硬、活动受限；②关节出现红、肿、热、痛，同时软组织肿胀或积液；③发病的部位常见于膝、髋、踝等关节处；④关节积液检查出现白细胞介素-1β(IL-1β)降低、透明质酸(HA)含量明显升高；⑤关节病理切片镜检出现关节腔大量渗出液，软骨表面粗糙，滑膜增生、粘连、肥厚等膝关节炎临床病理学改变，14 d后即得到稳定的类风湿性关节炎模型。注射后创口碘伏浸泡消毒1周(1次/d)以预防感染。

1.4治疗方法术后14 d造模成功后开始肌肉注射骨瓜提取物注射液治疗，骨瓜小剂量组(1 mg)及骨瓜大剂量组(5 mg)均连续治疗21 d。

1.5检测指标及方法参照文献[6]，于治疗后1、7、14、21 d分别抽取膝关节腔积液，采用酶标双抗体夹心ELISA法测定积液HA及IL-1β含量。参照文献[7]检测关节滑膜骨形态发生蛋白(BMPs)、软骨细胞MMP-1阳性表达。足肿胀度的测定：四组动物均于实验当天测量右足趾关节以下部位的容积，连续3次，取平均值为右足容积，计算各组动物足肿胀度。前后容积之差值为肿胀程度，计算足肿胀百分率：足肿胀度(%)=(造模后容积-造模前容积)/造模前容积×100%。记录各组动物消肿时间。

1.6数据统计使用SPSS 17.0软件，不同时点大鼠脑缺血再灌注EEG、rCBF比较采用重复测量方差分析，大鼠脑缺血梗死范围采用两两比较t检验，数据以±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1动物消肿时间及足肿胀度(%)比较骨瓜组在治疗后7 d开始消肿，21 d后已接近正常，足肿胀度明显低于模型组，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，骨瓜小剂量组与骨瓜大剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1　各组动物足肿胀度比较(n=10)

2.2大鼠关节积液HA、IL-1β含量比较骨瓜组IL-1β含量在治疗7 d开始明显下降，21 d后已接近正常水平，HA明显升高，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，骨瓜小剂量组与骨瓜大剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3大鼠关节滑膜治疗前后BMPs、软骨细胞MMP-1阳性表达比较骨瓜组BMPs明显升高，软骨细胞MMP-1阳性表达下降，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。骨瓜小剂量组与骨瓜大剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1　大鼠关节积液IL-1β、HA含量比较(n=10)

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表2　大鼠关节滑膜BMPs、软骨细胞MMP-1阳性表达比较(n=10)

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3讨论

骨瓜提取物注射液是用新鲜或冷冻的猪四肢骨和葫芦科植物甜瓜Cucumis melo L的干燥成熟种子提取物制成的注射液[8]，富含多种游离氨基酸、甜瓜籽提取物、多肽类骨代谢因子(骨代谢的活性肽类)、无机盐及微量元素等[9]，可调节骨代谢，刺激成骨细胞增殖，促进新骨形成以及调节钙、磷代谢，可增加骨钙沉积而防治骨质疏松，同时还具有镇痛抗炎作用[10]。

机体在罹患类风湿性疾病时，钙、磷代谢失衡而造成骨质疏松，四肢关节及关节滑膜均出现不同程度的炎性浸润，关节积液中可出现不正常的IL-1β分泌增多，HA减少，关节滑膜MMP-1阳性表达升高及BMPs降低的现象，故本文测定4组大鼠关节积液中HA及IL-1β含量、滑膜BMPs及MMP-1阳性表达、右足趾关节以下部位的容积并计算足肿胀度，记录各组动物消肿时间，评价骨瓜提取物注射液对大鼠类风湿性关节炎的治疗效果。

实验结果显示，治疗7、14、21 d时，治疗组MMP-1阳性表达及关节积液中IL-1β明显降低，BMPs及HA含量明显升高，消肿时间缩短，足肿胀度明显优于模型组，表明骨瓜提取物注射液治疗类风湿性关节炎能有效降低足肿胀度、IL-1β及MMP-1阳性表达，升高BMPs及HA，缩短消肿时间。其机制可能为机体在罹患类风湿性疾病时，骨瓜提取物注射液通过抑制IL-1β产生，减轻关节软骨和滑膜的炎症反应，减轻软骨细胞正常结构和功能的破坏、基质的降解，减少骨的吸收以及关节软骨周围骨赘的形成，从而减轻关节疼痛的临床症状以及关节软骨的破坏，改善关节功能。正常的关节滑液中仅含有微量的IL-1β，但在类风湿性关节液中IL-1β的含量则异常增高。IL-1β作为重要的炎性介质具有细胞破坏能力，其在退行性骨关节病中发挥着重要作用。HA是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺二糖单位有规律重复构成的大分子链状多糖，化学本质为糖胺多糖，广泛分布于人及动物的结缔组织、眼玻璃体、软骨和滑液中，是关节滑液和软骨基质的重要组成部分。HA可减少风湿性关节内炎性介质的扩散，减少滑膜的通透性及关节内渗液[11]。我们认为，滑液中HA含量升高是由于骨瓜提取物注射液促使滑膜内衬B型滑膜细胞和单核吞噬细胞分泌HA，从而起到润滑关节、保护关节软骨、延缓软骨退变的作用。这是一种“内源性”HA，与外源性HA关节腔内注射比较，其作用时间更为长久。由于骨瓜提取物注射液中富含多种游离氨基酸，为成骨细胞合成BMPs、TGF-β等骨源性生物因子提供能量和原料，促进骨源性生物因子的合成。研究证实，骨瓜提取物注射液中的多肽类骨代谢因子可以增加BMPs的合成，抑制MMP-1的过度表达。本研究认为，其促进BMPs合成的主要药理作用是促进成骨细胞有丝分裂及趋化作用[12]。BMPs作为一种骨诱导因子，是间充质细胞向骨系细胞转化的信号传导介质，具有诱导间充质细胞转化为成骨细胞和软骨细胞的作用。同时，BMPs还可通过调节TGF-β和FGF而诱导新骨形成，从而促进钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防治和改善骨质疏松的发生[13]。骨瓜提取物注射液中的甜瓜籽提取物能降低关节局部毛细血管通透性，减少IL-1β合成及炎性渗出，降低因炎症刺激而造成MMP-1细胞阳性表达，促进局部炎症及组织粘连时血运障碍的恢复，改善关节局部的血液循环。

综上所述，骨瓜提取物注射液通过调节关节积液中HA及IL-1β含量，滑膜BMPs及MMP-1阳性表达，影响关节及骨代谢，刺激成骨细胞增殖，调节钙、磷代谢，增加钙沉积，防治骨质疏松[14]，缩短消肿时间，具有明显的抗炎、镇痛作用。

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作者单位：内蒙古医科大学附属医院急诊科，呼和浩特 010059