白花蛇舌草的有效成分2-羟基-3-甲基蒽醌通过Fas/FasL信号通路诱导卵巢癌细胞凋亡

万小旭,张　行,王佳贺*

白花蛇舌草的有效成分2-羟基-3-甲基蒽醌通过Fas/FasL信号通路诱导卵巢癌细胞凋亡

万小旭a,张行b,王佳贺a*

[摘要]目的研究中药白花蛇舌草的有效成分2-羟基-3-甲基蒽醌对人卵巢癌细胞HO-8910生长的抑制作用和凋亡的影响。方法不同浓度的2-羟基-3-甲基蒽醌与人卵巢癌细胞HO-8910分别培养0、24、48、72 h，用台盼蓝染色法测定HO-8910细胞存活率；以Annexin V FITC/PI 双染流式细胞仪检测HO-8910细胞的凋亡率；Western blot法检测Fas和FasL蛋白的表达；采用荧光比色法测定Caspase-3和Caspase-8蛋白酶的活性。结果随着2-羟基-3-甲基蒽醌浓度的增加及作用时间的延长，药物对HO-8910细胞的生长有明显的抑制作用；HO-8910细胞的凋亡率亦随之增高，且呈药物浓度及时间依赖关系；2-羟基-3-甲基蒽醌作用HO-8910细胞后Fas和FasL的蛋白表达水平逐渐上升；Caspase-3和Caspase-8蛋白酶的表达亦逐渐增强；Caspase-3和Caspase-8抑制剂能够抑制2-羟基-3-甲基蒽醌诱导的HO-8910细胞凋亡。结论2-羟基-3-甲基蒽醌可以诱导HO-8910细胞凋亡，Fas/FasL通路在2-羟基-3-甲基蒽醌诱导的HO-8910细胞凋亡过程中起重要作用。

[关键词]白花蛇舌草；2-羟基-3-甲基蒽醌；HO-8910；凋亡

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of 2-Hydroxy-3-methylanthraquinone from Hedyotis diffusa on proliferation and apoptosis of human ovarian cancer cells HO-8910 and the expressions of Fas/FasL proteins.MethodsHO-8910 cells were cultured with different concentrations of 2-Hydroxy-3-methylanthraquinoe at different time points. Cell proliferation was detected by trypan blue stain；cell apoptosis was examined by flow cytometry；and the Fas/FasL protein was detected by Western blot assay.The activity of caspases was detected by colorimetric assay.Results2-Hydroxy-3-methylanthraquinoe induced apoptosis of HO-8910 cells in a time- and dose-dependent manner. The expression of Fas and FasL proteins increased after treatment by 2-Hydroxy-3-methylanthraquinoe. Moreover,treatment of HO-8910 cells with 2-Hydroxy-3-methylanthraquinoe resulted in activation of caspase-3 and caspase-8.The caspases inhibitors decreased apoptosis in HO-8910 cells.Conclusion2-Hydroxy-3-methylanthraquinoe can enhance the apoptosis of HO-8910 cells through Fas/FasL signaling pathway.

收稿日期：2015-04-16

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512002

2-Hydroxy-3-methylanthraquinone fromHedyotisdiffusaWilldinduces the apoptosis of HO-8910 cells through Fas/FasL signaling pathwayWAN Xiao-xua,ZHANG Hangb,WANG Jia-hea*(a.Department of Geriatrics，b.Department of Laryngology，Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Key words：HedyotisdiffusaWilld；2-Hydroxy-3-methylanthraquinone;HO-8910 cells；Apoptosis

0引言

卵巢癌是指生长在卵巢的恶性肿瘤。由于卵巢癌早期缺乏特异性症状，所以诊断比较困难，而晚期患者又疗效不佳[1]。白花蛇舌草是茜草科耳草属的植物[2]，最近研究表明，白花蛇舌草的有效成分2-羟基-3-甲基蒽醌对前列腺癌、胃癌、宫颈癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞具有明显的增殖抑制作用[3-5]。并有研究指出,白花蛇舌草注射液可以诱导卵巢癌细胞SKOV-3凋亡[6]。但2-羟基-3-甲基蒽醌对卵巢癌细胞株HO-8910细胞的抗肿瘤作用至今未见国内外相关报道。

本实验采用2-羟基-3-甲基蒽醌作用于体外培养的卵巢癌细胞HO-8910，用台盼蓝染色法检测不同浓度的药物作用不同时间后对卵巢癌HO-8910细胞的抑制作用，Annexin V FITC/PI 双染流式细胞术观察2-羟基-3-甲基蒽醌作用于卵巢癌HO-8910细胞后对其凋亡的影响，以及Western blot法检测Fas/FasL信号转导通路在此凋亡过程中的作用，为临床卵巢癌患者的治疗提供一定的理论参考。

1材料和方法

1.1材料人卵巢癌细胞株HO-8910 由中国医科大学中心实验室提供;细胞培养试剂购自Invitrogen 公司；Fas/FasL抗体、Caspase-3及Caspase-8抑制剂及其他所有试剂均购自Sigma 公司。离心机购自德国Eppendorf 公司;流式细胞仪购自美国Backman公司。2-羟基-3-甲基蒽醌购自上海樊克生物科技有限公司。

1.2HO-8910细胞培养HO-8910 细胞使用 DMEM 高糖培养基培养，细胞贴壁生长在含10% 胎牛血清及100 U/mL青霉素、100 μg/mL 链霉素的培养液中，细胞于5% CO2、饱和湿度及37℃条件下常规培养，隔日传代，取对数生长期的细胞用于下一步实验。

1.32-羟基-3-甲基蒽醌作用于HO-8910细胞当2-羟基-3-甲基蒽醌的浓度分别为0、25、50、100 μM时，与HO-8910细胞分别培养0、24、48、72 h。

1.4细胞活力测定收集对数生长期的HO-8910细胞，PBS洗3次，分装于24孔板，加入不同浓度的2-羟基-3-甲基蒽醌，每组设4个平行孔。细胞加药后置于37 ℃、5% CO2饱和湿度孵箱分别培养0、24、48、72 h，加入台盼蓝染色，用台盼蓝拒染法在镜下计数活细胞数。细胞死亡率为染成蓝色细胞占总细胞的百分率。

1.5Annexin V FITC/PI 双染流式细胞仪检测细胞凋亡收集处于对数生长期的HO-8910细胞，分别加入0、25、50、100 μM的2-羟基-3-甲基蒽醌，分别培养0、24、48、72 h后收集细胞，用PBS 洗细胞2次，离心 5 min (2 000 r/min)后取106细胞，加入60 μL的Binding Buffer 重悬;加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，再加入5 μL Propidium Iodide 混匀，并于室温下避光反应 15 min，细胞结合Annexin V-FITC 和PI 后，其结果采用CellQuest软件用流式细胞仪(FACS Calibur，BD Biosciences)进行分析。每个样品至少计数10 000个细胞。

1.6Western blot 检测各组细胞中Fas/FasL蛋白水平的表达2-羟基-3-甲基蒽醌(0、25、50、100 μM)分别处理0、24、48、72 h后，常规消化收集各组HO-8910细胞，按总蛋白抽提试剂盒操作步骤提取样本细胞总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度。等量蛋白用12%的SDS-聚丙烯酰氨凝胶 (SDS-PAGE)电泳。在恒定电流下电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，置于5%脱脂奶粉中予以室温封闭2 h。加入1∶1 000 稀释的一抗，4 ℃孵育过夜;TBST 洗膜 3 次;加入稀释的二抗(1∶6 000)，室温孵育1 h；TBST 洗膜3次，每次15 min。用抗β-actin 抗体标记。所有测量结果用抗β-actin 蛋白标志标准化。按PIERCE 化学发光试剂盒说明，用发光试剂浸润PVDF膜，X 线胶片在感光屏内曝光成像，结果在凝胶成相仪上照相。同一实验重复3 次。

1.7细胞内Caspase-3和Caspase-8蛋白酶活性测定收集并裂解对照组和2-羟基-3-甲基蒽醌处理组细胞，冰上孵育10 min后，4 ℃离心(10 000 r/min)10 min，收集上清液，测定蛋白浓度(BCA Protein Assay Reagent Kit，Pierce Biotechnology，美国)。分别加入反应缓冲液/DTT 混合物及特异性的荧光Caspase-3和Caspase-8底物，37 ℃水浴1 h。通过荧光分光光度计定量检测Caspases-3和Caspase-8蛋白酶的活性(激发波长370 nm，发射波长460 nm)。

1.8统计学分析应用SPSS 10.0 统计学软件分析数据，细胞凋亡率用±s表示。多组数据比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1细胞活力测定台盼蓝染色结果显示，随着2-羟基-3-甲基蒽醌的浓度增加及作用时间的延长，各实验组染成蓝色的细胞逐渐增多,提示坏死HO-8910细胞逐渐增多,HO-8910细胞存活率逐渐下降，结果见图1。

图1　2-羟基-3-甲基蒽醌对卵巢癌HO-8910细胞生长的影响

2.2Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测卵巢癌细胞系HO-8910细胞的凋亡情况结果见图2。不同浓度的2-羟基-3-甲基蒽醌作用于卵巢癌细胞系HO-8910细胞不同时间后细胞均发生凋亡，并且HO-8910的凋亡率随着2-羟基-3-甲基蒽醌浓度的增加及培养时间的延长而升高。当2-羟基-3-甲基蒽醌浓度为50 μM时，作用24、48、72 h后，HO-8910细胞的凋亡率与0 h比较，差异有统计学意义；当2-羟基-3-甲基蒽醌浓度分别为25、50、100 μM时，培养48 h后，HO-8910细胞的凋亡率与0 μM比较，差异有统计学意义。

图2　Annexin V FITC/PI 双染流式细胞仪检测卵巢癌细胞

2.32-羟基-3-甲基蒽醌对Fas/FasL信号转导通路的影响50 μM 的2-羟基-3-甲基蒽醌作用不同时间后，免疫印迹法检测Fas/FasL蛋白的表达。结果显示，随着药物作用时间的延长，Fas/FasL蛋白的表达亦逐渐增加，见图3。

图3　2-羟基-3-甲基蒽醌(50 μM)作用于卵巢癌细胞HO-8910

2.4Caspase-3及Caspase-8活性测定当2-羟基-3-甲基蒽醌浓度为50 μM时，随着作用时间的延长，caspase-3及Caspase-8蛋白酶的活性亦逐渐增加。作用24、48、72 h后与0 h比较，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.001)。当2-羟基-3-甲基蒽醌浓度分别为25、50、100 μM时，培养48 h后，caspase-3、Caspase-8的活性随着2-羟基-3-甲基蒽醌浓度的增加而升高，与0 μM比较，差异有统计学意义。结果见图4。

2.5Caspase-3及Caspase-8抑制剂对HO-8910细胞凋亡率的影响加入Caspase-3及Caspase-8抑制剂后，HO-8910细胞的凋亡率与加入50 μM的2-羟基-3-甲基蒽醌相比明显降低，结果见图5。

图4　2-羟基-3-甲基蒽醌作用于卵巢癌细胞HO-8910后

图5　Annexin V FITC/PI 双染流式细胞仪分析检测加入Caspase-3

3讨论

虽然卵巢癌的发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌，居妇科恶性肿瘤的第3位，但死亡率却高居妇科癌症的首位，严重威胁着女性的健康和生命安全[7-8]。大量实验研究发现，大多数中药抗肿瘤药物均可诱导敏感的卵巢癌细胞发生凋亡，从而发挥其抗肿瘤作用[9-10]。白花蛇舌草分布在日本以及中国大陆的南方等地[11]，多生长于山地岩石上，生长于海拔1 800米的地区。其中成药味苦、淡。常用于治疗肿瘤、热症、肠胃痛、泌尿系统疾病等[12-14]。但是，目前关于白花蛇舌草抗肿瘤的机制，特别是对体外培养的卵巢癌细胞株的影响国内外尚无更深入的研究，还不能从根本上对该药的抗卵巢癌作用及其机制进行解释。

细胞凋亡是由基因控制的程序性细胞死亡，其机制较为复杂[15-16]。对人类来说，诱导细胞凋亡主要有外源性(死亡受体介导通路)和内源性(线粒体凋亡通路)两条途径[17]。Fas/FasL 通路又称死亡受体通路，在细胞增殖、降解和细胞凋亡过程中发挥着重要的作用[18]。Fas是肿瘤坏死因子受体之一，是一种由325 个氨基酸组成的跨膜蛋白受体分子，又称CD95。Fas能通过与其配体FasL 结合而诱导细胞发生凋亡[19]。Fas 主要是通过胞内段的DD (Death domain)和FADD (Fas-associating protein with death domain)羧基端的DD 之间的相互作用，募集细胞质中的衔接蛋白FADD;FADD 再通过死亡效应结构域与Caspase-8 结合形成死亡诱导信号复合体，从而激活Caspase-8及其下游的Caspase 家族成员，最终诱导细胞凋亡[18]。 本课题应用台盼蓝染色法检测不同作用时间、不同浓度的2-羟基-3-甲基蒽醌对卵巢癌细胞株HO-8910 细胞的生长抑制情况。结果表明，随着2-羟基-3-甲基蒽醌浓度的升高、作用时间的延长，卵巢癌HO-8910 细胞的死亡率不断上升，呈剂量-时间依赖关系。Annexin V FITC/PI 双染流式细胞仪分析结果表明，2-羟基-3-甲基蒽醌能够以时间和剂量依赖的方式诱导人卵巢癌细胞株HO-8910细胞凋亡，并且HO-8910细胞凋亡的机制涉及Fas/FasL信号转导通路。Caspase-3和Caspase-8的活性亦随着2-羟基-3-甲基蒽醌作用时间的延长而增加，而加入Caspase-3和Caspase-8的抑制剂可使HO-8910细胞的凋亡率降低，说明Fas/FasL信号转导通路在2-羟基-3-甲基蒽醌诱导的HO-8910细胞凋亡过程中起到了重要的作用。

本研究证实了2-羟基-3-甲基蒽醌对卵巢癌细胞株HO-8910 细胞具有体外抑制及诱导凋亡作用，其机制涉及死亡受体通路，为今后2-羟基-3-甲基蒽醌应用于卵巢癌的临床治疗提供了理论依据。

参考文献：

[1]Jatoi A,Foster NR,Kalli KR,et al.Prior oral contraceptive use in ovarian cancer patients:assessing associations with overall and progression-free survival[J].BMC Cancer,2015,15(1):711.

[2]Kuo YJ,Lin JP,Hsiao YT,et al.Ethanol extract of Hedyotis diffusa Willd affects immune responses in normal Balb/c mice In Vivo[J].In Vivo,2015,29(4):453-460.

[3]Wang N,Li DY,Niu HY,et al.2-hydroxy-3-methylanthraquinone from Hedyotis diffusa Willd induces apoptosis in human leukemic U937 cells through modulation of MAPK pathways[J].Arch Pharm Res，2013，36(6):752-758.

[4]Shi Y,Wang CH,Gong XG.Apoptosis-inducing effects of two anthraquinones from Hedyotis diffusa WILLD[J].Biol Pharm Bull，2008，31(6):1075-1078.

[5]Lin J,Wei L,Shen A,et al.Hedyotis diffusa Willd extract suppresses Sonic hedgehog signaling leading to the inhibition of colorectal cancer angiogenesis[J].Int J Oncol，2013，42(2):651-656.

[6]余萍.白花蛇舌草注射液诱导SKOV-3 细胞株凋亡的研究[J].中国药业，2012，21(18):24-25.

[7]Mahran YF,El-Demerdash E,Nada AS,et al.Growth hormone ameliorates the radiotherapy-induced ovarian follicular loss in rats:Impact on oxidative stress,apoptosis and IGF-1/IGF-1R axis[J].PLoS One，2015，10(10):e0140055.

[8]Wu YH,Chiu WT,Young MJ,et al.Solanum incanum extract downregulates aldehyde dehydrogenase 1-mediated stemness and inhibits tumor formation in ovarian cancer cells[J].J Cancer，2015，6(10):1011-1019.

[9]Zhang J,Wang W,Qian L,et al.Ursolic acid inhibits the proliferation of human ovarian cancer stem-like cells through epithelial-mesenchymal transition[J].Oncol Rep，2015，34(5):2375-2384.

[10]Kim BR,Lee EJ,Seo SH,et al.Dickkopf-3 (DKK-3) obstructs VEGFR-2/Akt/mTOR signaling cascade by interacting of β2-microglobulin (β2M) inovarian tumorigenesis[J].Cell Signal,2015，27(11):2150-2159.

[11]Li C,Zhao Y,Guo Z,et al.Effective 2D-RPLC/RPLC enrichment and separation of micro-components from Hedyotis diffusa Willd.and characterization by using ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2014，99:35-44.

[12]Niu Y,Meng QX.Chemical and preclinical studies on Hedyotis diffusa with anticancer potential[J].J Asian Nat Prod Res，2013，15(5):550-565.

[13]Dong Q,Ling B,Gao B,et al.Hedyotis diffusa water extract diminished the cytotoxic effects of chemotherapy drugs against human breast cancer MCF7 cells[J].Nat Prod Commun,2014，9(5):699-700.

[14]Cai Q,Lin J,Wei L,et al.Hedyotis diffusa Willd inhibits colorectal cancer growth in vivo via inhibition of STAT3 signaling pathway[J].Int J Mol Sci，2012，13(5):6117-6128.

[15]Huang XP,Ding H,Lu JD,et al.Effects of the combination of the main active components of astragalus and panax notoginseng on inflammation and apoptosis of nerve cell after cerebral ischemia-reperfusion[J].Am J Chin Med，2015:1-20.

[16]Qi S,Kou X,Lv J,et al.Ampelopsin induces apoptosis in HepG2 human hepatoma cell line through extrinsic and intrinsic pathways:Involvement of P38 and ERK[J].Environ Toxicol Pharmacol，2015，40(3):847-854.

[17]Yang J,Liu XX,Fan H,et al.Extracellular vesicles derived from bone marrow mesenchymal stem cells protect against experimental colitis via attenuating colon inflammation,oxidative stress and apoptosis[J].PLoS One,2015，10(10):e0140551.

[18]Cho HM,Sun W.Control of mitochondrial dynamics by Fas-induced caspase-8 activation in hippocampal neurons[J].Exp Neurobiol，2015，24(3):219-225.

[19]Peyvandi S,Buart S,Samah B,et al.Fas ligand deficiency impairs tumor immunity by promoting an accumulation of monocytic myeloid-derived suppressor cells[J].Cancer Res，2015，75(20):4292-4301.

作者单位：沈阳军区总医院神经医学研究所，沈阳 110016