胃癌患者CD4+/8+ T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3表达水平及意义

冯　吉

(杭州市下沙医院普外科，浙江　杭州　310000)



胃癌患者CD4+/8+T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3表达水平及意义

冯吉

(杭州市下沙医院普外科，浙江杭州310000)

目的观察胃癌患者外周血、癌旁组织和癌组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim3)的表达情况及其对CD4+T细胞和CD8+T细胞功能的影响。方法抽取胃癌患者外周血，通过密度梯度离心法分选获取外周血单个核细胞(PBMC)。获取的肿瘤组织及癌旁组织标本经研磨法获取肿瘤浸润T细胞。通过流式细胞染色的方法检测胃癌患者外周血、癌旁组织和癌组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面Tim3的表达情况。激活Tim3信号后，通过流式细胞术胞内染色的方法检测CD4+T细胞和CD8+T细胞表达肿瘤坏死因子(TNF)-α和穿孔素的能力。结果与胃癌患者外周血CD4+/8+T细胞表面Tim3表达水平相比，胃癌患者癌旁组织和癌组织浸润CD4+/8+T细胞表面Tim3表达水平显著升高(P<0.01)；且与胃癌患者癌旁组织浸润CD4+/8+T细胞表面Tim3表达水平相比，胃癌患者癌组织浸润CD4+/8+T细胞表面Tim3表达水平显著升高(P<0.01)。激活Tim3信号后，CD4+T细胞分泌TNF-α的能力显著降低(P<0.01)，同时CD8+T细胞分泌穿孔素的能力亦显著降低(P<0.01)。结论胃癌组织CD4+T细胞和CD8+T细胞表面Tim3表达水平的升高可能与胃癌的进展密切相关。

胃癌；T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3

胃癌患者的免疫系统处于免疫抑制状态。与CD4+/CD8+T细胞功能抑制相关的分子包括程序性死亡分子(PD-1)和T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim3)等〔1～3〕。关于胃癌患者CD4+/CD8+T细胞表面PD-1分子的表达及功能已有文献报道〔4〕，而关于Tim3在胃癌患者CD4+/CD8+T细胞表面的表达及功能还未见文献报道。研究胃癌患者外周血、癌旁组织和癌组织中CD4+/CD8+T细胞表面Tim3的表达情况及其对CD4+T细胞和CD8+T细胞功能的影响，有利于揭示胃癌患者的免疫抑制机制，干扰CD4+/CD8+T细胞的免疫抑制状态，可能成为治疗胃癌的新靶点。

1　材料与方法

1.1临床资料选取2014 年10月30日至2015年9月30日在我科住院并行手术治疗的胃癌患者20例。患者术前均未接受化学治疗、放射治疗或免疫治疗，收集患者癌组织标本，同时收集20例患者癌旁组织标本作为对照。组织标本离体后10 min 内冻存于液氮中保存。每例样本均经过组织病理学诊断证实为胃癌。20例患者的平均年龄为(53.12±11.35)岁。

1.2外周血单个核细胞(PBMC)获取无菌抽取患者外周血，以无菌PBS稀释1倍。稀释血液加入预先加有淋巴细胞分离液(稀释血液∶淋巴细胞分离液为2∶1)的离心管中，1 800 r/min离心20 min。吸取中间白色的淋巴细胞白膜层，加入预装10 ml PBS的离心管中，1 500 r/min离心15 min。弃尽PBS，以10 ml PBS重悬细胞沉淀，1 200 r/min离心8 min。获取的细胞即为PBMC，可用于后续实验。

1.3Tim3染色方法上述分离获取的PBMC以1 ml含1% BSA的PBS洗涤2次，每次5 min。弃尽上清，加入0.1 ml含1% BSA的PBS。随后加入相应的抗体(CD3、CD4、CD8和Tim3)。4℃孵育30 min。以1 ml含1% BSA的PBS洗涤2次，每次5 min。弃尽上清，加入0.1 ml含1% BSA的PBS后进行流式细胞检测。

1.4胞内染色方法细胞预先以适量的PMA和Ion于37℃预处理6 h。收取细胞后以1 ml含1% BSA的PBS洗涤2次，按1.3方法先进行CD3、CD4和CD8染色。染色结束后细胞以透化液洗涤2次，加入肿瘤坏死因子(TNF)-α和穿孔素抗体。室温避光孵育30 min。以透化液洗涤2次。弃尽上清，加入0.1 ml含1% BSA的PBS后进行流式细胞检测。

1.5统计学方法采用GraphPad软件，两组数据比较采用t检验，多组数据比较采用ANOVA分析。

2　结　果

2.1外周血、癌旁组织和胃癌组织中CD4+T细胞Tim3表达胃癌患者外周血CD4+T细胞表面Tim3表达阳性百分比为(2.29±1.44)%；癌旁组织CD4+T细胞表面Tim3表达阳性百分比为(6.16±3.37)%；癌组织中表达阳性百分比为(24.11±6.37)%，组间比较差异显著(P<0.01)。

2.2外周血、癌旁组织和胃癌组织中CD8+T细胞Tim3表达胃癌患者外周血CD8+T细胞表面Tim3表达阳性百分比为(2.69±1.36)%；癌旁组织为(8.05±3.52)%；胃癌患者癌组织浸润CD8+T细胞表面Tim3表达阳性百分比为(33.73±7.63)%，组间比较差异显著(P<0.01)。

2.3Tim3对CD4+T细胞分泌细胞因子能力的影响对照组CD4+TNF-α+细胞百分比为(33.93±6.31)%，激活Tim3信号通路后CD4+TNF-α+细胞百分比为(20.41±4.47)%。Tim3可显著抑制CD4+T细胞TNF-α分泌能力(P<0.01)。

2.4Tim3对CD8+T细胞杀伤能力的影响对照组CD8+Perforin+细胞百分比为(36.35±7.73)%，激活Tim3信号通路后CD8+Perforin+细胞百分比为(21.38±5.03)%。Tim3可显著抑制CD8+T细胞的杀伤能力(P<0.01)。

3　讨　论

Tim家族成员主要包括Tim1、Tim3和Tim4〔5〕。Tim3是一种负性调节分子，主要表达于分化成熟的Th1型细胞表面〔6〕。现在，Tim3、细胞毒性淋巴细胞相关抗原(CTLA)-4及程序性死亡分子(PD)-1都被归类于免疫系统抑制受体家族〔6,7〕。大量研究显示Tim3在多种肿瘤组织中的表达与肿瘤的进展密切相关〔8,9〕。

除外与肿瘤的发生和发展密切相关，Tim3已知和T细胞耗竭密切相关〔10〕。文献研究显示，在多种肿瘤组织浸润的CD4+/CD8+T细胞表面Tim3的表达水平均出现显著升高〔4〕。结果提示，Tim3可能参与了胃癌发生发展过程中CD4+/CD8+T细胞功能的耗竭，从而促进了胃癌的发生和发展。为了进一步明确胃癌患者中CD4+/CD8+T细胞表面过表达的Tim3和CD4+/CD8+T细胞功能的关系，本研究采用活化抗体激活CD4+/CD8+T细胞表面表达的Tim3。结果提示，Tim3可显著抑制CD4+T细胞的细胞因子分泌能力和CD8+T细胞的杀伤功能。

综上述所，本研究结果初步证实胃癌患者癌组织浸润CD4+/CD8+T细胞表面Tim3表达水平显著升高，且升高的Tim3可抑制CD4+/CD8+T细胞的功能，提示胃癌组织CD4+T细胞和CD8+T细胞表面Tim3表达水平升高可能与胃癌进展密切相关。

1Hassan SS,Akram M,King EC,etal.PD-1,PD-L1 and PD-L2 gene expression on T-cells and natural killer cells declines in conjunction with a reduction in PD-1 protein during the intensive phase of tuberculosis treatment〔J〕.PLoS One,2015;10(9):e0137646.

2Park HJ,Park JS,Jeong YH,etal.Correction:PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells〔J〕.J Immunol,2015;195(12):5841-2.

3Ngiow SF,von Scheidt B,Akiba H,etal.Anti-TIM3 antibody promotes T cell IFN-γ-mediated antitumor immunity and suppresses established tumors〔J〕.Cancer Res,2011;71(10):3540-51.

4Arai Y,Saito H,Ikeguchi M.Upregulation of TIM-3 and PD-1 on CD4+ and CD8+ T cells associated with dysfunction of cell-mediated immunity after colorectal cancer operation〔J〕.Yonago Acta Med,2011;55(1):1-9.

5Shakhov AN,Rybtsov S,Tumanov AV,etal.SMUCKLER/TIM4 is a distinct member of TIM family expressed by stromal cells of secondary lymphoid tissues and associated with lymphotoxin signaling〔J〕.Eur J Immunol,2004;34(2):494-503.

6Markwick LJ,Riva A,Ryan JM,etal.Blockade of PD1 and TIM3 restores innate and adaptive immunity in patients with acute alcoholic hepatitis〔J〕.Gastroenterology,2015;148(3):590-602.

7Ma Y,Liu X,Zhu J,etal.Polymorphisms of co-inhibitory molecules(CTLA-4/PD-1/PD-L1) and the risk of non-small cell lung cancer in a Chinese population〔J〕.Int J Clin Exp Med,2015;8(9):16585-91.

8Li Z,Li N,Zhu Q,etal.Genetic variations of PD1 and TIM3 are differentially and interactively associated with the development of cirrhosis and HCC in patients with chronic HBV infection〔J〕.Infect Genet Evol,2013;14:240-6.

9Ngiow SF,Teng MW,Smyth MJ.Prospects for TIM3-targeted antitumor immunotherapy〔J〕.Cancer Res,2011;71(21):6567-71.

10Jayaraman P,Sada-Ovalle I,Beladi S,etal.Tim3 binding to galectin-9 stimulates antimicrobial immunity〔J〕.J Exp Med,2010;207(11):2343-54.

〔2015-11-15修回〕

(编辑徐杰)

冯吉(1981-)，男，硕士，住院医师，主要从事胃肠乳腺甲状腺肿瘤研究。

R73

A

1005-9202(2016)16-3883-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.006