骨髓间充质干细胞成骨分化中信号转导途径与雌激素受体的关系



骨髓间充质干细胞成骨分化中信号转导途径与雌激素受体的关系

林思文1王丽丽2施剑明1殷明

(南昌大学第二附属医院骨一科，江西南昌330006)

〔关键词〕成骨分化;雌激素受体;信号通路

妇女在绝经后由于体内雌激素生成及分泌减少，骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化能力减弱，导致成骨细胞生成减少，骨骼不能对适度负荷产生足够的适应性骨重建，容易引起骨质疏松，甚至发生骨折。雌激素可以通过直接调节、旁分泌和细胞凋亡等机制作用于成骨细胞和破骨细胞而发挥作用，促进成骨细胞及抑制破骨细胞增殖，影响骨代谢，防治骨质疏松〔1〕。对于预防及治疗绝经后妇女骨质疏松，保持体内雌激素水平尤为重要〔2〕。

所有关系到骨形成和骨吸收的细胞均表达雌激素受体(ERs)〔3〕。ER具有6个结构区：A区和B区共同构成激活功能域(AF)-1；C区为位于C-末端的DNA结合域(DBD)，包含2个锌指结构,其与DNA编码雌激素反应元件(EREs)密切相关；D区调节配体的结合、受体二聚化、核易位、泛素相关修饰因子(UMO)化和乙酰化；E区包含配体结合域(LBD)和AF-2；F区被认为是区分雌二醇(E2)和其他ERs激动剂的活动区。ER转录活性依赖于N-末端的两个AFs：A/B区的AF-1受体和E区的AF-2。AF-1是非配体依赖性的，而AF-2则是配体依赖性的。当DBD区与DNA结合后,AF-1即可激活DNA转录活性,而AF-2与LBD区重叠,可与雌激素直接结合从而激活DNA的转录。虽然AF-1和AF-2可以独立运行，当这两者协同作用时才能实现ER的最大转录〔4,5〕。

成骨细胞具有两个不同核受体超家族成员，即ERα和ERβ，相关配体通过与ERα及ERβ结合对成骨细胞发挥生物学效应，ERα和ERβ在DNA和配体结构域上有很高的同源性，两种受体亚型已明确是由位于不同染色体上的不同基因编码的蛋白质，ERα由人6号染色体长臂编码，ERβ由人14号染色体短臂编码〔6〕。传统观点认为，雌激素通过结合ERα和ERβ，从而激活ER信号转导途径诱导成骨〔7〕。研究表明，ERs也能够通过与某些信号通路之间的联系促进成骨诱导。

1ER与骨保护素(OPG)/核因子(NF)-κB受体活化因子(RANK)/RANK配体(RANKL)信号通路

正常骨重建及骨吸收的稳定主要依靠RANKL和OPG的平衡。RANKL是一类膜结合分子，属于肿瘤坏死因子(TNF)配体家族成员，对破骨细胞形成至关重要。目前发现，RANKL具有两种特异性受体：破骨细胞的前体细胞表面表达的膜信号受体RANK和分泌型诱饵受体OPG〔8〕。RANKL与RANK结合，上调破骨细胞靶基因表达，促进破骨细胞增殖及分化〔9〕。而OPG属于TNF受体超家族成员，受各种激素、细胞因子及间充质的转录因子调节。作为一种可溶性受体，OPG由间充质干细胞(MSCs)及成骨细胞产生，可阻断RANKL与RANK结合，从而抑制破骨细胞形成〔10〕。因此，OPG的高表达有利于BMCSs的成骨分化〔11〕。

雌激素可导致人类成骨细胞OPG和ER基因表达的mRNA和蛋白显著增加。雌激素导致ER的表达和诱饵受体OPG的上调表明：成骨细胞可能参与调节雌激素所致的骨合成代谢。Bord等〔12〕将成骨细胞分组培养24 h后，低剂量(10-9mol/L)17β-E2组RANKL mRNA表达被抑制(P<0.05)，而高剂量(10-7mol/L)组则无变化(P>0.05);ERα、ERβ、OPG mRNA的表达在高剂量组无变化，仅ERα mRNA在低剂量时高表达。然而当加入ER拮抗剂ICI182,780与E2联合干预24 h后，无论高、低剂量组均没有出现OPG、RANKL、ER表达增高的情况。这说明，雌激素通过ER(主要是ERα)诱导成骨可能与OPG/RANK/RANKL通路的激活有关。

2ER和骨形态发生蛋白(BMP)-2/smads信号通路

BMP-2属于转化生长因子(TGF)-β的超基因家族成员，在成骨细胞分化和骨形成方面具有重要作用〔13〕。约30个骨形成蛋白家族成员被鉴定，其中BMP-2被确定为一个调节成骨细胞分化的关键信号〔14〕。几项利用转基因小鼠的研究表明，BMP-2是参与骨固有再生能力的一个基本组成部分〔15〕，因此，BMP-2可以被认为是促进骨形成的某些促蛋白合成药的一个潜在靶点。Mundy等〔16〕构建筛选模型,确定他汀类药物作为有效的BMP-2激活剂,在体内具有刺激骨形成的作用。此外，一些天然化合物包括蛇床子素、金雀黄素和淫羊藿苷等也能通过BMP-2通路对骨代谢发挥保护作用〔17~19〕。已知在MSCs中,BMP能诱导碱性磷酸酶(ALP)表达和成骨分化〔20〕。经典的BMP-2/smads信号通路是BMP-2激活其信号转导蛋白Smad中的受体调节型Smads(R-Smads：Smad1、Smad5、Smad8)使之与共同中介型Smads(Co-Smads：Smad4)形成复合体，转移至细胞核内对靶基因转录进行调节〔21〕。

Song等〔22〕发现辛伐他汀对ALP活性的刺激作用不完全是通过中和BMP-2被阻断，ERα蛋白水平在辛伐他汀作用于小鼠BMCSs 72 h后上调。辛伐他汀对BMCSs ALP活性的增强可被ICI182,780阻断，17β-E2和辛伐他汀联用相比辛伐他汀可增加2~3倍ALP活性。这些结果表明，辛伐他汀诱导的小鼠BMCSs体外成骨，至少部分通过ERα及BMP-2途径。

3ER和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路

PI3K由85 kD的调节亚基p85和110 kD的催化亚基p110两个亚基构成，通过癌基因Ras和p110 直接结合、与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用引起二聚体构象改变两种途径被激活，在胞膜上产生第二信使3-磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3与胞质内的Akt结合，使Akt转运到胞膜上而被活化。磷脂酰肌醇依赖蛋白激酶(PDK)1使Akt 蛋白苏氨酸磷酸化位点(Thr308)磷酸化，同时哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTORC)2则使Akt蛋白的丝氨酸磷酸化位点(Ser473)磷酸化，Akt功能才充分激活，从而调节细胞增殖、分化、凋亡等生理活动。Wang等〔23〕用葛根素干预成骨细胞MG-63，发现其ERα短发夹样RNA(shRNA)、ERβ shRNA、ALP活性及胶原蛋白含量均上调，而ICI182,780和PI3K特异性抑制剂渥曼青霉素均能明显下调葛根素诱导的成骨细胞磷酸化(P)Akt的表达，抑制其增殖、ALP活性及胶原蛋白含量。另有研究证明，ERα 与PI3K的调节亚基p85结合后活化PI3K/Akt， 激活后的Akt能够使ERα的丝氨酸残基ser167磷酸化而被激活，因此可能存在ER/PI3K/Akt通路〔24〕。这些结果提示，PI3K/Akt通路对ERα的活性具有调节作用， 反过来ERα也可调节PI3K/Akt通路的活性。

4ER和Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)

Wnt信号已被证明是一种促进MSCs向软骨及成骨细胞分化的有效通路〔25〕。在经典Wnt通路中，Wnt配体结合Frizzled受体及其共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5/6，使Dishevelled(Dsh)蛋白磷酸化，从而抑制下游的糖原合酶激酶(GSK)-3β Axin和大肠腺瘤息肉蛋白(APC)与磷酸化的β-catenin结合〔26〕。β-catenin作为T-细胞因子(TCF)和淋巴增强因子(LEF)的共同转录激活因子，成为经典Wnt信号的关键部分。积聚在细胞质的非磷酸化β-catenin易位至细胞核，结合转录因子TCF/LEF而调节下游Wnt信号靶基因的表达〔27〕。

17β-E2以ER依赖途径通过Wnt通路转录效应器TCF增加基因启动子活性，并能增加氯化锂(LiCl)对TCF活性的刺激作用。氯化锂能通过雌激素反应元件增加17β-E2的刺激作用，同时也会因一个非经典的Wnt受体激动剂(WAG)进一步增强。而相比LiCl，WAG增加DNA的合成和减小相对胶原合成和ALP活性。此外，WAG抑制成骨特异性转录因子(Runx)2、Osterix(OSX)和ALP mRNA水平，并能有效诱导OPG mRNA表达。17β-E2和Wnt通路之间在蛋白质水平存在明确的交集，其中ERα与β-catenin独立结合的结构域TCF-4紧密关联。McCarthy等〔28〕研究发现成骨细胞增殖、分化，涉及ERα和TCF-4的激活，受17β-E2和Wnt信号途径共同影响。

5ER和丝裂原活化蛋白激酶(MEK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路

ERK包括ERK1和ERK2,是将信号从表面受体传导至细胞核的关键，ERK是有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一员，控制着细胞增殖、分化、死亡等多种生理过程。其基本信号传递遵循MAPK三级酶促级联的特点：即上游激活蛋白→MAPK激酶的激酶(MAPKKK)→MAPK激酶(MAP-KK)→MAPK。在ERKs的传递途径中Ras作为上游激活蛋白，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Raf)作为MAPKKK，MAPK/ERK激酶(MEK)作为MAPKK，即Ras-Raf-MEK-ERK途径。

活化的ERK信号途径是促进成骨细胞增殖的主要因素之一，已报道包括胰岛素、糖皮质激素、高压氧、成纤维细胞生长因子(FGF)-6〔29~32〕在内的诸多物质可以通过ERK途径促进成骨细胞增殖、分化。Song等〔33〕的数据表明，淫羊藿苷可以通过激活ERK通路促进成骨细胞增殖、分化和矿化，另外，淫羊藿苷作为一个植物雌激素可以激活ERs信号通路或与细胞核中ERs复合物进行合作而发挥生物学效应。Prouillet等〔34〕发现体外槲皮素和山柰酚能显著提高成骨细胞ALP活性，而ICI182，780和ERK通路阻滞剂PD98059均能明显抑制这种效应，ICI182，780能抑制黄酮所诱导的ERK的激活。以上数据表明，ER和MEK/ERK通路在成骨细胞中能够相互依赖地发挥作用。Runx-2作为主要成骨转录因子参与成骨细胞成熟过程，并且它对骨钙蛋白的表达起至关重要作用，OSX是一种新型的含锌指转录因子，在骨发育中呈特异性表达，OSX位于Runx-2的下游，其表达依赖于Runx-2〔35〕，同时，以上信号通路均可调节Runx/OSX的表达〔36~39〕。

此外，各个信号通路间可以相互作用，影响成骨。研究发现〔40〕，Wnt信号活跃于各种成骨细胞及其前体细胞系中，包括MC3T3-E1、2T3、C2C12和C3H10T1/2细胞。Wnt可以被看作为BMP的一个上游调节因子，Wnt3a所致Wnt信号的激活和β-catenin/TCF4的过表达均能激活BMP-2基因在启动子或mRNA水平上的转录。与此相反，成骨细胞中的BMP-2转录可以通过Wnt阻滞剂(DKK1)、血清分泌型卷曲蛋白(SFRP)4阻断Wnt信通路或F-盒子蛋白1/β重组转录蛋白(FWD1/β-TrCP)、同位素编码亲和标记物(ICAT)、ΔTCF抑制β-catenin/TCF4活动而下降。Nie等〔41〕也发现OPG/RANK/RANKL通路与Wnt信号的相互作用关系。然而，上述信号途径均与ER相关，因此调节ER的表达与BMSCs的成骨分化密切相关。

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〔2015-04-01修回〕

(编辑王一涵)

〔中图分类号〕R592

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1267-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.110

通讯作者：殷明(1958-)，男，教授，博士生导师，主任医师，主要从事创伤、脊柱研究。

1南昌大学研究生院医学部2九江学院基础医学院

第一作者：林思文(1989-)，男，在读硕士，主要从事创伤医学研究。