吡格列酮对前脂肪细胞分化及GILZ蛋白表达的影响*

王毅飞，　伊　娜，　吴琳英，　黄晓淳，　梁思虹

(1广州医科大学附属第一医院内分泌科， 广东 广州 510120；2广州市中医院内分泌科，广东 广州510130)



吡格列酮对前脂肪细胞分化及GILZ蛋白表达的影响*

王毅飞1△，伊娜2，吴琳英1，黄晓淳1，梁思虹1

(1广州医科大学附属第一医院内分泌科， 广东 广州 510120；2广州市中医院内分泌科，广东 广州510130)

[摘要]目的： 探讨吡格列酮在3T3-L1前脂肪细胞分化及糖皮质激素诱导亮氨酸拉链(GILZ)蛋白表达调节方面的作用。方法: 形态观察3T3-L1细胞分化过程，不同浓度吡格列酮(1×10-4mmol/L～1×10-2mmol/L)处理细胞48 h，然后于分化的第2、4、6天用油红O染色测定细胞甘油三酯相对含量，实时荧光定量PCR法检测过氧化物增殖活化受体(PPAR)γ2 和脂蛋白酶(LPL)的mRNA表达。不同浓度药物处理细胞48 h后，Western blot检测GILZ蛋白表达。结果: 油红O法显示甘油三酯相对含量随药物处理浓度的增加而增加，与对照组比，1×10-3mmol/L和1×10-2mmol/L组甘油三酯含量显著性增加(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测显示PPARγ2、LPL的mRNA表达也是随着药物处理浓度的增加而增加。与对照组比，吡格列酮高于1×10-3mmol/L浓度时，PPARγ2、LPL的mRNA表达显著性增加(P<0.01)。Western blot显示GILZ蛋白表达随着药物处理浓度的增加而降低。结论: 吡格列酮可下调GILZ表达，上调PPARγ2及下游LPL的表达。

[关键词]吡格列酮； 糖皮质激素诱导亮氨酸拉链； 脂肪细胞分化； 过氧化物增殖活化受体γ2； 3T3-L1细胞

脂肪细胞是哺乳动物的一类重要功能细胞,在维持脂类代谢及能量代谢平衡方面发挥关键作用。大量的实验证明，长期使用糖皮质激素会导致骨髓脂肪细胞数量增加、骨质疏松、胰岛素抵抗、血脂异常、肥胖和糖尿病等[1]。在脂肪细胞形成过程中, 作为细胞相关信号通路作用靶点的转录因子——过氧化物增殖活化受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)被认为起了极其重要的作用。吡格列酮(pioglitazone)属噻唑烷二酮类(thiazolidinediones，TZDs)胰岛素增敏剂，是人工合成型PPARγ的高亲和性配体激活剂，已广泛用于 2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者的治疗，已被报道其可通过激活PPARγ2，调节下游靶基因表达，发挥促进脂肪细胞分化发育、改善胰岛素抵抗、抗炎等作用[2-3]。

糖皮质激素(glucocorticoid，GC)具有诱导细胞生长、分化和凋亡等多种功能，已经被广泛用于抗炎、免疫抑制等方面的治疗。但是长期使用糖皮质激素，会加速骨的丢失导致骨质疏松，取而代之的是骨髓脂肪细胞数量的增加。糖皮质激素诱导亮氨酸拉链(glucocorticoid-induced leucine zipper，GILZ)蛋白是一种糖皮质激素诱导蛋白，被报道可通过抑制脂肪细胞分化而拮抗糖皮质激素的副作用。GILZ属于亮氨酸拉链转录因子家族成员, 我们先前的研究及其它国外研究表明GC可上调GILZ表达，后者通过下调脂肪细胞分化转录因子PPARγ2、C/EBPα的表达而抑制下游脂肪代谢必需基因脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)等的表达，进而抑制脂肪细胞的分化，GILZ可作为一种转录抑制因子调节下游基因的表达[4-6]。

那么吡格列酮是否对GILZ表达有影响尚不清楚，为了进一步探讨吡格列酮诱导脂肪细胞分化的药理作用机制，本文试图通过研究吡格列酮对前脂肪细胞分化及GILZ、PPARγ2、LPL等表达的影响，探讨吡格列酮对前脂肪细胞分化的影响。

材料和方法

1主要材料

牛血清、DMEM(HyClone)；吡格列酮、油红O、地塞米松、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤、胰岛素(Sigma)；PVDF膜(Bio-Rad)；羊抗小鼠GILZ的 I 抗(Santa Cruz)；驴抗羊IRDye 800的II抗(LI-COR)；TRIzol(Invitrogen)；实时荧光定量(real-time) PCR 试剂(Promega)。其它试剂为国产分析纯。

2主要方法

2.13T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化将3T3-L1前脂肪细胞接种于12孔或6孔培养板，采用含10% 胎牛血清的DMEM完全培养液。在37 ℃、5% CO2条件下培养，每2～3 d换液 1 次。待细胞生长至完全融合后2 d，开始诱导分化,将培养液换为脂肪细胞诱导剂(含0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤、0.25 μmol/L地塞米松和10 mg/L胰岛素的DMEM完全培养液)处理48 h。随后换含10 mg/L胰岛素的DMEM培养液孵育48 h。在诱导同时，加入不同浓度吡格列酮(1×10-4mmol/L～1×10-2mmol/L)。然后以不含任何诱导剂的10% DMEM完全培养液继续培养，每2 d换培养液 1 次。

2.2油红O染色法生化测定甘油三酯相对含量取分化的3T3-L1细胞，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定液固定细胞5 min。去掉多聚甲醛固定液，再加相同体积的多聚甲醛固定液固定细胞至少1 h。去掉多聚甲醛固定液，60%异丙醇洗 1 次。细胞完全晾干，加油红O工作液于细胞表面，静置10 min。弃油红O染液，立即流水洗至背景透明。油红O染色的细胞于室温完全晾干，加0.4 mL 100%异丙醇, 静置10 min以上，用tip头反复吹打几次，使油红O完全溶解，转移到新的1.5 mL EP管使用，检测500 nm的吸光度(A)值(空白对照100%异丙醇)。

2.3实时荧光定量PCR法检测以不同浓度吡格列酮(1×10-4mmol/L～1×10-2mmol/L)处理细胞，取诱导的第6天(day 6th, D6)的3T3-L1前脂肪细胞，按Invitrogen的TRIzol说明书提取细胞总RNA。200 μL PCR反应管中依次加入如下试剂进行逆转录合成cDNA：RNA 抽提物1 μg，计算补水量至总体积25 μL;立即放入冰浴中，然后依次加入RNasin 1 μL，Oligo(dT)随机引物 2 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，5×RT 缓冲液 5 μL，MMLV 逆转录酶 1 μL，在PCR仪上70 ℃ 10 min。然后以1 μL合成的cDNA为模版，依次加入2×Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，加ddH2O至总反应体系20 μL。95 ℃ 5 min;94 ℃ 30s,56 ℃ 30s,72 ℃ 30s,共40个循环;72 ℃ 10 min进行PCR扩增。测定各样品的Ct值，以管家基因β-actin为内参照对待测样品的Ct值进行校正，计算校正值2-ΔΔCt进行统计分析。

选取脂肪细胞分化相关标志物PPARγ2和LPL检测，根据PPARγ2和LPL的mRNA在Genbank中的序列设计引物，见表1。

F: forward; R: reverse;

2.4Western blot实验收集不同浓度吡格列酮处理48 h的3T3-L1细胞，加RIPA裂解液，高速离心后，测上清蛋白浓度。取60 μg蛋白样品经SDS-PAGE后半干电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h，加GILZ的 I 抗(1∶1 000)，室温1 h,TBST洗3次，加抗羊IRDye 800的 II 抗(1∶2 000)，室温反应1 h，TBST洗涤3次，Odyssey红外荧光成像系统上扫描显像。

3统计学处理

数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。用SPSS 16.0统计软件进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1吡格列酮对脂肪细胞分化的影响

诱导前的3T3-L1前脂肪细胞成纤维形、梭形或多角形，细胞核为圆形，位于细胞质中央。换成分化培养基诱导分化第2天，细胞内开始观察到反光的脂质小滴，并随着分化的进展越来越多的细胞出现脂质小滴，而且单个细胞内的脂质小滴的数目逐渐增加，并使细胞的形状由多角形逐渐变为椭圆形或圆形，到了分化的第6天左右，脂肪细胞内的脂肪小滴会相互融合成较大的淡黄色脂肪滴。形态学初步观察到吡格列酮组比无药物处理的对照组细胞分化程度高，见图1。

Figure 1.The effection of pioglitazone (1×10-2mmol/L) on 3T3-L1 cells differentiation (×200).

图1吡格列酮对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

进一步用油红O法生化测定分化脂肪细胞内甘油三酯相对含量。显示各浓度吡格列酮均促进3T3-L1前脂肪细胞的分化，在诱导分化的第2、4、6天所测得A值均高于阴性对照组，其中1×10-3和1×10-2mmol/L能显著地促进前脂肪细胞的分化(P<0.05)，见表2。

表2吡格列酮对3T3-L1前脂肪细胞甘油三酯相对含量的影响

Table 2.The effection of pioglitazone on relative content of triglyceride during 3T3-L1 cells differentiation (Mean±SD.n=3)

*P<0.05,**P<0.01vs0 mmol/L.

2吡格列酮对脂肪细胞分化相关标志物PPARγ2和LPL mRNA表达的影响

不同吡格列酮浓度诱导后，real-time PCR法检测分化第6天的3T3-L1细胞内PPARγ2和LPL的mRNA表达，结果显示随着吡格列酮浓度的增加，PPARγ2和LPL的mRNA表达也相应增加。1×10-4mmol/L吡格列酮组与对照组比较，PPARγ2和LPL的 mRNA表达虽增加，但差异没有统计学显著性。而1×10-3mmol/L吡格列酮组PPARγ2和LPL的mRNA表达则显著提高(P<0.01)，1×10-3mmol/L和1×10-2mmol/L吡格列酮组PPARγ2的mRNA表达分别增加了2.56和3.00倍，LPL的mRNA表达分别增加了1.73和1.93倍，见图2。

3吡格列酮对脂肪细胞GILZ蛋白表达的影响

Western blot结果显示: 与对照组比较，随着吡格列酮浓度的增加，GILZ蛋白表达降低，尤其是1×10-3mmol/L和1×10-2mmol/L组3T3-L1前脂肪细胞的GILZ表达较对照组明显降低(P<0.01)，见图3。

Figure 2.The effect of pioglitazone on the mRNA expression of PPARγ2 and LPL during differentiation of 3T3-L1 cells detemined by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

图2Real-time PCR检测吡格列酮对3T3-L1脂肪细胞过氧化物增殖活化受体γ2和脂蛋白酶mRNA表达的影响

Figure 3.The effect of pioglitazone on the protein expression of GILZ in 3T3-L1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mmol/L.

图3吡格列酮对3T3-L1脂肪细胞GILZ蛋白表达的影响

讨论

前脂肪细胞是脂肪细胞的一种, 由多能干细胞(multipotential stem cells，MSCs)或胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)分化而来。脂肪细胞分化异常是导致肥胖的主要途径之一，脂肪组织除了是被动的能量储存器官,而且还是多种激素类物质分泌的内分泌器官；脂肪细胞分化与调控失常可导致人类多种疾病如肥胖症、糖尿病、脂肪肝、高脂血症及乳腺癌等发生。肥胖被认为是2型糖尿病、心血管疾病及其它慢性疾病的主要危险因子。改善前脂肪细胞的分化可能是治疗或预防糖尿病的策略之一[4,7]。

细胞分化的本质是基因表达模式的转变。前脂肪细胞在多种转录因子的调控下, 激活多个脂肪组织相关基因, 并在这些基因的顺序性协调控制下, 经过一系列复杂的步骤后才分化成成熟脂肪细胞。过氧化物增殖活化受体家族是一类能被过氧化物酶体增殖物激活的核内受体，是调节脂肪形成的主要转录因子之一，在脂肪组织分化过程中起了重要的作用。PPARs家族由3个不同基因编码组成核内受体PPARα、PPARβ和PPARγ等亚型。PPARα和PPARβ分别同机体的脂质代谢及细胞的基础脂质代谢有关, PPARγ与脂肪细胞分化关系更为密切。由于启动子和拼接方式不同, PPARγ分为PPARγ1、PPARγ2及PPARγ3 3种亚型。PPARγ2主要在脂肪组织中表达，因此,在脂肪组织分化过程中, PPARγ2尤为重要，被认为是调控脂肪细胞分化的关键分子，有的称是主控调节子[8-9]。PPAR通过与下游靶基因启动子上的PPAR反应元件结合而激活基因表达[10]。它的表达可以促使脂肪细胞分化、调节细胞周期及许多细胞系的终末脂肪细胞分化等[11]。由于脂肪细胞分化过程中，PPARγ2表达会增加，因此，PPARγ2被认为既是脂肪细胞分化转录因子，又是脂肪细胞分化相关标志基因。

目前临床主要用于治疗2型糖尿病、改善胰岛素抵抗的药物是胰岛素增敏药噻唑烷二酮类，主要有吡格列酮和罗格列酮。TZDs作为PPARγ的配体，激活PPARγ，从而调控其下游多种基因的转录表达，促进脂肪细胞的分化。本实验检测结果显示吡格列酮上调PPARγ2和LPL mRNA表达，增加脂肪细胞内甘油三酯，促进脂肪细胞的分化，与文献所报道结果一致[12]。促脂肪分化的作用目前被认为是吡格列酮作为治疗2型糖尿病药物改善胰岛素抵抗的重要原因，同时也可以解释吡格列酮引起腹部皮下脂肪增加的副作用。

GILZ是由D’Adamio等[13]在比较糖皮质激素地塞米松(dexamethasone，DEX)处理和非DEX处理的鼠胸腺细胞mRNA表达差异时发现的一种亮氨酸拉链蛋白家族新成员。已发现GILZ具有多种生物学功能，如选择性的保护T细胞激活凋亡，抗炎及参与肾集合管细胞Na+通道的调节。GILZ能与HDAC1、NF-κB、Ap1等多种蛋白发生相互作用，并参与Fas/FasL、NF-κB、Ap1、MAPKs成员Raf21等多条信号通路的信号传递，因此，GILZ是一种重要的信号蛋白分子[13-14]。后来发现GILZ有抑制脂肪细胞分化的功能，国外和我们先前的实验[4,6]均表明单独GILZ过表达可显著性抑制PPARγ2、C/EBPα、LPL 和FAS的mRNA表达从而抑制脂肪细胞的分化，因此,GILZ被认为是一种PPARγ2的转录抑制因子。本实验结果显示随着吡格列酮浓度的增加，GILZ蛋白表达降低，表明吡格列酮可调节GILZ的表达。那么吡格列酮促进脂肪细胞分化是否通过下调GILZ表达，然后上调PPARγ2表达的还需要进一步研究。糖皮质激素在临床应用过程中，发现有引起脂肪细胞异常分化、加重胰岛素抵抗等副作用，长期使用还可能会导致肥胖及2型糖尿病的发生。文献还报道TZDs可通过促进PPARγ的表达激活胰岛素信号转导，促进下游与胰岛素效应有关的涉及葡萄糖的产生、转运、利用及脂肪代谢的多种基因的转录，从而改善胰岛素抵抗[15]。本实验结果显示吡格列酮不仅促进PPARγ2的表达，而且抑制了GILZ表达，因此，糖皮质激素诱导的GILZ信号转导通路和胰岛素信号转导通路在吡格列酮调节脂肪细胞分化和胰岛素抵抗中的路径及交汇的节点，值得进一步研究。

深入研究吡格列酮和GILZ对脂肪细胞的分化调控机制有助于更好地了解糖脂代谢障碍及胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生机制。随着未来它们分子作用机制的不断阐明，调节GILZ表达有可能成为治疗2型糖尿病的新靶点。那么由于吡格列酮这种明显的促脂肪细胞分化作用，如对于某些糖皮质激素导致的肥胖或糖尿病患者，其应用可改善糖皮质激素引起的脂肪细胞异常分化，改善葡萄糖信号的转导，更好地防治糖皮质激素导致的糖脂代谢障碍和2型糖尿病的发生。

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Effect of pioglitazone on pre-adipocytes differentiation and GILZ expression

WANG Yi-fei1, YI Na2, WU Lin-ying1, HUANG Xiao-chun1, LIANG Si-hong1

(1DepartmentofEndocrinology,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China;2DepartmentofEndocrinology,TraditionalChineseMedicineHospitalofGuangzhou,Guangzhou510130,China.E-mail:wangyifeigz@126.com)

[KEY WORDS]Pioglitazone; Glucocorticoid-induced leucine zipper; Adipocytes differentiation; peroxisome proliferator-activated receptor γ2; 3T3-L1 cells

[ABSTRACT]AIM: To investigate the roles of pioglitazone on differentiation and expression of GILZ in 3T3-L1 pre-adipocytes. METHODS: The morphological changes during 3T3-L1 cell differentiation were observed. The cells were treated with pioglitazone at concentrations of 1×10-4～1×10-2mmol/L for 48 h, then the relative content of triglyceride were analyzed by oil red O staining at 2nd, 4th and 6th day during adipogenesis. The mRNA expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ2 (PPARγ2) and lipoprotein lipase (LPL) was measured by real-time PCR. GILZ protein expression was determined by Western blot after the cells were treated with pioglitazone at concentrations of 1×10-4～1×10-2mmol/L for 48 h.RESULTS: Oil-red O staining showed that the relative contents of triglyceride in adipocytes were increased with the increase in the pioglitazone concentration. Compared with the control, the relative contents of triglyceride in group 1×10-3mmol/L and group 1×10-2mmol/L were significantly increased (P<0.05). The mRNA expression of PPARγ2 and LPL was also increased with the increase in the pioglitazone concentration. When pioglitazone concentration was more than 1×10-3mmol/L, compared with the control, the mRNA expression of PPARγ2 and LPL significantly increased (P<0.01). The protein expression of GILZ was decreased with the increase in the pioglitazone concentration.CONCLUSION: Pioglitazone down-regulates GILZ expression, and up-regulate PPARγ2 expression and the downstream functional factor such as LPL.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1122- 05

[收稿日期]2016- 01- 07[修回日期] 2016- 04- 25

*[基金项目]广东省科技计划(No. 2013B021800195);广东省医学科学技术研究基金资助项目(No. A2014291)

通讯作者△Tel: 020-83062299; E-mail: wangyifeigz@126.com

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.027