创伤性脑损伤后大鼠外周血CD8的变化*

李　卫，　郑　然，　蔡　康，　郑　宽，　王兆瑞

(1暨南大学附属第一医院神经外科，广东 广州 510630；2香港大学临床医学研究中心，中国 香港)



创伤性脑损伤后大鼠外周血CD8的变化*

李卫1△，郑然2，蔡康1，郑宽1，王兆瑞1

(1暨南大学附属第一医院神经外科，广东 广州 510630；2香港大学临床医学研究中心，中国 香港)

[摘要]目的： 探讨外周血CD8在创伤性脑损伤后的变化特点。方法: 改良Feeney′s自由落体打击法制备创伤性脑损伤模型；ELISA检测大鼠血清中神经元特异性烯醇化酶(NSE)和CD8的含量，双变量分析两者的相关性；Western blot法检测大鼠血液淋巴细胞FasL蛋白的表达。结果: 颅脑外伤后大鼠血清CD8升高滞后于NSE。大鼠伤后1 d 血清NSE水平即显著升高，伤后3 d达到峰值，随后逐渐下降；大鼠血清CD8在伤后3 d开始升高，峰值出现在伤后7 d，随后逐渐下降。统计分析显示伤后1 d、3 d、7 d的血清的NSE与伤后3 d、7 d、14 d的血清CD8含量变化呈现正相关。但伤后不同时间大鼠血液淋巴细胞FasL蛋白表达的差异均无统计学显著性。结论: 创伤性脑损伤后释放入血的NSE刺激机体免疫应答，引起外周血CD8增多，推测其可能与创伤性脑损伤后继发性损伤的免疫应答有关。

[关键词]创伤性脑损伤； 神经元特异性烯醇化酶； CD8； FasL

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是神经外科常见疾病，TBI所致的严重神经功能障碍和巨大经济负担，尤其是重症颅脑损伤患者存在疗效差、致残率和死亡率高的问题，已成为全球性难题。TBI是由于各种机械外力作用所致的颅脑损伤，根据其病理过程可以分为原发性和继发性脑损伤两个阶段。原发性脑损伤是指外力引起的脑组织直接损伤；继发性损伤是在原发性损伤基础上产生的二次脑损伤，伤后立即开始，可持续数小时至数周。临床研究显示在致死性TBI病例中70%～90%病人出现继发性脑损伤。由于无法干预原发性损伤，临床治疗TBI的重点多放在继发性脑损伤的防治上。因此，阐明继发性脑损伤的发生机制对提高TBI的疗效和预后具有重要意义。

研究发现TBI后继发性脑损伤的发生与损伤局部脑组织的炎症反应、血脑屏障的破坏、兴奋性氨基酸释放、Ca2+超载及氧化应激等一系列病理变化有关[1-3]。这些机制的阐明为TBI治疗提供了新的理念和方法，如钙通道阻滞剂和自由基清除剂的应用可改善TBI患者的疗效。但迄今为止，TBI患者的治疗依然存在预后不佳的情况。近年来免疫应答在脑损伤中的作用受到越来越多的关注。本课题组以前的研究发现，在TBI大鼠脑组织损伤灶及其周边有大量CD8+T淋巴细胞浸润，并且相应区域神经元凋亡数量也明显增多，推测自身免疫反应可能参与继发性脑组织损伤的过程[4]。本研究拟观察TBI后大鼠血液循环中CD8的变化特点，结合既往的研究结果从整体水平探讨TBI后机体的免疫反应状况，以期为TBI治疗提供新的策略。

材料和方法

1材料

1.1仪器自制改良Feeney′s自由落体打击装置，见图1。高速冷冻离心机为Eppendorf产品；垂直电泳仪及转移系统为Bio-Rad产品；多功能酶标仪为Tecan Safire产品。

1.2实验动物与试剂雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠为SPF级，体重(200±20)g，购于广东省医学实验动物中心(合格证编号为SCXK粤2008-0002)。外周血淋巴细胞分离液为天津灏洋生物公司产品；蛋白提取液为碧云天生物公司产品；ECL化学发光试剂盒购自Pierce；兔抗大鼠FasL单克隆抗体为Epitomics产品；检测大鼠CD8和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)的ELISA试剂盒为CusaBio产品。

2方法

2.1颅脑损伤模型制作采用改良的Feeney′s自由落体打击装置建立右顶叶局部重型脑挫伤模型(图1)。大鼠先行右顶骨开窗，直径为5 mm，保持硬脑膜完整。撞击锤重量为30 g，高度35 cm，自由落下，撞击硬脑膜下的脑组织，形成稳定的脑挫伤范围，约为4 mm×4 mm×3 mm大小。假手术组给予顶骨开窗，但不进行脑组织撞击。外伤后各组大鼠均出现不同程度的肢体活动障碍，且有部分死亡。外伤后存活大鼠纳入实验组，其左侧肢体活动障碍均在48 h内恢复正常。

Figure 1.Improved feeney’s free fall hit device (A) and severe brain injury in right parietal lobe (B).

图1改良Feeney’s自由落体打击装置及右顶叶局部重型脑挫伤

2.2动物分组SD大鼠饲养在12 h/12 h明暗交替环境中，自由饮水和进食，室温和相对湿度分别维持在(22±2)℃和(45±5)%，适应性喂养1周后，随机分成假手术组和和TBI组，其中TBI组又分为伤后1 d、3 d、7 d和14 d组。

2.3ELISA测定TBI后血清中CD8和NSE的含量收集伤后不同时段大鼠血液，血液凝固后3 000 r/min离心10 min获取血清样本。将血清样本加入酶标孔内孵育，测定方法按照ELISA试剂盒说明书进行。标准曲线制作参照说明书，设定8个标准浓度梯度。

2.4Western blot印迹法检测FasL的表达收集大鼠伤后不同时段血液，抗凝处理后用PBS等体积稀释血液，使用淋巴细胞分离液处理后获取淋巴细胞。加入预冷的细胞裂解缓冲液振荡混匀，超声裂解，冰浴30 min，后4 ℃ 12 000×g离心5 min，取上清-80 ℃保存。使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。调整样品的蛋白量进行SDS-PAGE，将电泳分离的蛋白转移到PVDF膜上(100 V真空电转移1 h)。PBST洗膜5 min。室温下用含5%脱脂奶粉的PBST封闭PVDF膜1 h。随后加入抗FasL的I抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。PBST洗脱3次，加入相应的II抗(稀释倍数均为1∶1 000)孵育1 h，漂洗3次。将PVDF膜用发光试剂ECL孵育1 min，暗室中曝光到X光片上。最终扫描分析结果。

3统计学处理

实验数据经统计软件SPSS 13.0进行分析，用均数±标准差误(mean±SEM)表示，两组间均数比较采用配对t检验；同组间不同时间点的均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用SNK-q检验进行组间均数的多重比较。脑损伤后不同时间点血清NSE和CD8的含量变化采用Pearson积矩相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1TBI后大鼠血清中NSE的水平

ELISA检测结果显示，颅脑外伤术后1 d血清中NSE的水平即显著升高，伤后3 d达到峰值，相比对照组高出20倍(P<0.01)，随后逐渐下降，伤后14 d下降至较低水平，见图2。

Figure 2.The serum level of NSE at different time points after TBI measured by ELISA. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vssham.

图2TBI后不同时间段血清NSE的水平

2TBI后大鼠血清中CD8的水平

ELISA检测结果显示，颅脑外伤术后3 d血清中CD8水平开始上升，伤后7 d达到峰值，随后逐渐降低，术后第14 天下降明显(图3)。术后1 d假手术组和TBI组血清CD8分子水平较高，可能与手术造成的早期应激有关。

Figure 3.The serum level of CD8 at different time points after TBI measured by ELISA. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vssham.

图3TBI后不同时间段血清CD8的水平

3TBI后血清中CD8和NSE水平的相关性

血清CD8的升高滞后于NSE，故将伤后1 d、3 d和7 d的血清NSE对应伤后3 d、7 d和14 d的血清CD8分子进行双变量相关性分析，从散点图可见这3个对应时间点血清中NSE含量上升与CD8上升呈正相关(P<0.05)，见图4。

Figure 4.The correlation of CD8 and NSE in the serum at diffe-rent time points after TBI.

图4TBI后不同时间血清中NSE与CD8表达的相关性

4TBI后外周血淋巴细胞FasL的表达

Western blot法检测颅脑外伤后不同时间大鼠血液淋巴细胞FasL蛋白的表达情况，结果显示伤后1 d、3 d、7 d和14 d的大鼠血液淋巴细胞中的FasL蛋白表达差异均无统计学显著性,见图5。

Figure 5.The expression of FasL in the lymphocytes at different time points after TBI determined by Western blot. Means±SEM.n=3.

图5TBI后不同时间外周血淋巴细胞FasL蛋白的表达

讨论

NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶，在脊髓和周围神经节均有分布，但主要分布于大脑神经元。颅脑损伤造成神经元、神经纤维和神经胶质细胞的破坏，尤其是血脑屏障的损伤，使脑内特异性神经元相关蛋白释放入血[3-5]。因此，血液NSE表达水平升高作为反映脑组织损伤程度的重要指标[6]。本研究显示，大鼠在颅脑损伤后早期(伤后1～3 d)即表现为血清中NSE水平剧烈升高，说明脑原发性创伤造成了神经元的直接损伤；随后(伤后3～14 d)血液NSE水平逐渐下降，反映了机体对神经细胞损伤后的修复。血清CD8作为CD8+T淋巴细胞膜抗原主要的廓清形式，其表达水平反映了血清中CD8+T淋巴细胞的活性。后者在机体适应性免疫应答中发挥重要功能，其主要作用是特异性直接杀伤靶细胞。血清CD8在体液中呈均相分布，较T细胞亚群测定更精确反映机体免疫状况，被视为敏感的免疫激活标志。我们在实验中发现，大鼠颅脑外伤后3 d血清中CD8水平开始升高，7 d达到峰值，与血清中的NSE相比呈现明显的滞后性。相关性分析显示大鼠伤后1 d、3 d和7 d的血清NSE与伤后3 d、7 d和14 d的血清CD8之间存在正相关，提示颅脑外伤后血液中CD8增多可能与受损神经元释放NSE入血有关。胚胎发育期即存在的血脑屏障使脑组织成为相对免疫豁免器官，外伤后血脑屏障的破坏使NSE释放入血，NSE作为特异性抗原刺激机体免疫系统，大量的CD8+T细胞在脾脏增殖后进入血液循环。与我们的研究结果一致的是，在液压冲击所致的脑损伤小鼠也表现出伤后外周血淋巴细胞数量增多，而抑制抗原处理和呈递可逆转这一过程[7]。本研究结果再次证实外伤后释放的神经组织抗原是机体免疫应答的重要诱发因子。

Fas/FasL通路是多种因素引起细胞凋亡的关键途径[8]。CD8+T细胞活化后大量表达FasL，与靶细胞表面的Fas分子结合后序列性地启动细胞凋亡。本研究显示颅脑损伤后不同时间段大鼠血液淋巴细胞FasL蛋白表达的差异并无统计学显著性，提示颅脑损伤后外周血中淋巴细胞数量尽管增多，却没有明显活化。分析其原因可能与外周血中缺乏含有特异抗原的靶细胞(神经细胞)，故不能引起淋巴细胞FasL表达和活化。和我们的推论一致的是，闭合性颅脑损伤小鼠伤后7 d脑组织中FasL表达明显升高，并伴有白细胞浸润和神经细胞凋亡，说明颅脑损伤引起脑内淋巴细胞的活化[9]。本课题组既往研究显示TBI后大鼠脑组织损伤灶及周边区域有大量CD8+T淋巴细胞浸润，并伴有明显的神经元凋亡[4]。综上所述，我们推测，外伤后神经组织受损使得大量NSE释放入血，刺激机体的免疫系统，导致大量CD8+T细胞在脾脏增殖后进入外周血液循环，损伤的神经组织因暴露特异抗原可招募外周血淋巴细胞至脑损伤灶[10]，活化后引起神经元凋亡，成为继发性脑损伤的诱因之一。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Variation of CD8 after traumatic brain injury in serum of rats

LI Wei1, ZHENG Ran2, CAI Kang1, ZHENG Kuan1, WANG Zhao-rui1

(1DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510630,China;2TheCenterofClinicalMedicalResearch,HongkongUniversity.Hongkong,China.E-mail:tliwei@jnu.edu.cn)

[KEY WORDS]Traumatic brain injury; Neuron-specific enolase; CD8; FasL

[ABSTRACT]AIM: To explore the character of CD8 after traumatic brain injury (TBI) in peripheral blood. METHODS: Improved Feeney’s free-fall method was used to set up traumatic brain injury model. The levels of neuron-specific enolase (NSE) and CD8 in the serum of the rats were detected by ELISA. The correlation of both NSE and CD8 in the serum was analyzed by Pearson product-moment correlation. The FasL expression in the lymphocytes of peripheral blood was determined by Western blot. RESULTS: The elevated level of CD8 lagged behind the level of NSE in the serum after TBI. The serum level of NSE was significantly increased at the 1st day after TBI and reached a peak at the 3rd day, subsequently gradually decreased to a lower level; the serum level of CD8 was increased at the 3rd day after TBI, and reached a peak at the 7th day, then gradually decreased. The serum levels of NSE at 1st, 3rd and 7th days were positively correlated with the serum level of CD8 at 3rd, 7th and 14th days. However, the FasL expression in the CD8+lymphocytes of peripheral blood showed no variation at different time points after TBI. CONCLUSION: NSE in the serum released from neural tissues after TBI stimulates immune response and induces the augmentation of CD8 in peripheral blood, which may be a cause of secondary injuries in the brain.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1062- 04

[收稿日期]2016- 04- 20[修回日期] 2016- 05- 27

*[基金项目]广东省科技计划 (No. 2014A020212444)

通讯作者△Tel: 020-38688878； E-mail: tliwei@jnu.edu.cn

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.017