Sirtuin 6对肝癌细胞增殖的影响*

陶娜娜，　周洪钟，　任吉华，　陈　祥，　李宛蔚，　刘　波，　陈　娟

(重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆 400016)



Sirtuin 6对肝癌细胞增殖的影响*

陶娜娜，周洪钟，任吉华，陈祥，李宛蔚，刘波，陈娟△

(重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆 400016)

[摘要]目的： 探究sirtuin 6 (SIRT6)对肝癌细胞增殖的影响。方法: RT-qPCR检测200例肝癌病人及50例健康人外周血中的SIRT6的mRNA表达水平，并将肝癌病人外周血SIRT6的mRNA表达水平与多个临床病理参数相结合进行统计学分析。Western blotting检测SIRT6在原代肝细胞、永生化肝细胞及肝癌细胞系中的蛋白表达水平。在肝癌细胞中利用shRNA干扰SIRT6基因的表达，并通过Western blotting验证沉默效率；MTS实验检测SIRT6基因沉默对肝癌细胞活力的影响。EdU标记实验检测SIRT6基因沉默对肝癌细胞DNA合成的影响；平板集落实验检测SIRT6基因沉默对肝癌细胞集落形成能力的影响；软琼脂集落形成实验检测SIRT6基因沉默对肝癌细胞锚定非依赖生长能力的影响。结果: SIRT6在肝癌病人的外周血中表达明显增高，且SIRT6的表达量增高与肿瘤的大小、肿瘤的分级以及肿瘤的血管侵袭相关。进一步验证发现SIRT6在肝癌细胞系中表达水平较原代肝细胞PHH及永生化肝细胞MIHA增高。在2个肝癌细胞系中沉默SIRT6可以抑制肝癌细胞的活力及DNA合成能力，也可抑制肝癌细胞集落形成能力及锚定非依赖生长能力。结论: SIRT6促进肝癌细胞的增殖及恶性转化。

[关键词]Sirtuin 6； 肝细胞癌； 细胞增殖

原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)在全球肿瘤死亡率中居第2位[1]。近期对各种癌症发病率的统计数据显示，原发性肝癌的全球年龄标准化发病率为10.1/100 000，其中男性发病率约为女性的3倍[2]。在原发性肝癌中，约有80%为肝细胞癌(he-patocellular carcinoma，HCC)。肝细胞癌的全球发病率在男性中排名第五，女性中排名第七[2]。肝细胞癌起病隐匿，具有发现晚，放化疗及手术切除效果差，预后不良等特点，并最终导致肝细胞癌的死亡率较高[3]。恶性增殖是肝细胞癌最重要病理特征，故研究肝细胞癌恶性增殖的分子调节机制对于肝细胞癌的干预治疗具有重要的意义。

Sirtuin家族是酵母中沉默信息调节因子2(silent information regulator 2，Sir2)的哺乳动物同源蛋白。Sirtuin家族是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)[4]。目前发现人类的sirtuin家族共有7个成员，它们的细胞定位不同，各自发挥着重要的生理作用。SIRT1、6、7位于细胞核，SIRT2位于细胞质，SIRT3、4、5位于线粒体[5]。研究证实sirtuin家族成员通过对组蛋白及多种非组蛋白进行去乙酰化修饰来调节基因表达[6-7]，参与细胞分化、凋亡、衰老、能量代谢及应激耐受等多种重要的生理活动，从而在多种肿瘤的形成和发展过程中发挥着重要的作用[8]。SIRT6定位于细胞核异染色质中，同时具有ADP-核糖基转移酶和去乙酰化酶活性。研究发现SIRT6可在多种肿瘤中发挥作用。但对SIRT6在肿瘤形成过程中起促进或抑制作用尚存争议。且目前关于SIRT6对肝细胞癌增殖及恶性转化的影响尚不明确。在本研究中，我们从肝癌病人的外周血样本入手，首先检测了在200例肝癌病人及50例健康人外周血SIRT6的mRNA表达水平，并将SIRT6的表达水平与多个临床病理参数进行统计学分析。进一步检测SIRT6在正常肝组织、永生化肝细胞及肝癌细胞系中的蛋白表达水平。并在肝癌细胞中沉默SIRT6基因的表达来观察其对肝癌细胞增殖及恶性转化的影响。因此，本研究有助于进一步了解肝癌细胞增殖的分子机制，为寻找新的肝细胞癌治疗药物靶点提供了依据。

材料和方法

1材料

200例肝癌病人及50例健康人外周血均来源于重庆医科大学附属第二医院。肝癌细胞系SK-Hep-1、PLC/PRF/5、SMMC-7721及永生化肝细胞系MIHA购于ATCC；肝癌细胞系Huh-7购于HSRRB；HM培养基和原代肝细胞系PHH购自ScienCell；人外周血淋巴细胞分离液购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；GV248-shcont、GV248-shSIRT6-1和GV248-shSIRT6-2质粒购于吉凯基因；SIRT6抗体购于Novus Biologicals；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG及NC膜购于GE；GAPDH及辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购于Santa Cruz；BCA试剂盒购于Thermo；Cell-LightTMEdU Apollo®488InVitroImaging Kit试剂盒购于锐博公司；CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂(MTS实验)购于Promega；TRIzol试剂购于Invitrogen；逆转录试剂盒购于Bio-Rad；质粒转染试剂、FastStart Universal SYBR Green Master Mix及EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets (PI) 购于Roche；opti-MEM及DMEM购于Gibco。

2方法

2.1RT-qPCR在试管中加入淋巴细胞分离液，再吸取等体积血液样本加于分离液之液面上。500×g离心30 min。离心后试管中由上至下分为4层，第1层为血浆层,第2层为环状乳白色淋巴细胞层,第3层为透明分离液层,第4层为红细胞层。用吸管小心吸取第2层环状乳白色淋巴细胞层到另一试管中，生理盐水洗涤。1 mL TRIzol裂解，提取总RNA。取1 μg逆转录为cDNA，随后进行PCR检测，以β-actin为内参照。设置复孔3个。以2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达水平。

2.2细胞培养PHH细胞培养于HM培养基中；肝癌细胞系SK-Hep-1、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Huh-7及永生化肝细胞系MIHA均培养于含有10% 胎牛血清、1% 青-链霉素的DMEM培养基中。上述细胞均在含有5% CO2、37 ℃孵箱中常规培养。

2.3质粒转染接种8×104SK-Hep-1或Huh-7细胞于6孔板中。24 h后更换培养基为无抗生素的DMEM。并将2 μg质粒与6 μL转染试剂加入200 μL opti-MEM中充分混匀，静置15 min后逐滴加入6孔板中。转染24 h后更换培养基为完全培养基。

2.4Western blotting实验收集细胞，用适量含PI的RIPA裂解液使细胞充分裂解，4 ℃摇床裂解20 min， 16 000×g离心5 min，取上清于新的EP管中。BCA试剂盒测蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，每孔上样量为30 μg蛋白，将蛋白转至NC膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，SIRT6 I抗4 ℃摇床孵育过夜，II抗室温孵育2 h。以GAPDH为内参照。

2.5MTS实验转染24 h后将shControl组与shSIRT6组细胞分别消化计数，并接种8 000个于96孔板中。分别于转染后2 d、3 d、4 d和5 d向96孔板中加入20 μL MTS试剂，37 ℃孵育2 h，490 nm检测吸光度(A)值。操作按照Promega试剂说明书进行。

2.6EdU标记实验在接种之前将盖玻片加入6孔板中，转染3 d后进行EdU实验，操作按照锐博生物试剂盒说明书进行。

2.7平板集落实验转染24 h后换液，在培养基中加入0.25 μmol/L嘌呤霉素。每3 d换1次液，当细胞长至50%以上时重新传代，3周后可观察到肉眼可见的明显集落，甲醇固定后0.1%结晶紫染色。

2.8软琼脂集落形成实验将浓度为1.2%的琼脂糖凝胶与含有20%血清的2×DMEM充分混匀后加入6孔板中，作为底层胶。转染24 h后进行细胞计数，将2 000个细胞加入含有20%血清的2×DMEM中，并与0.7%琼脂糖凝胶混匀作为上层胶加入6孔板中。每3 d向6孔板中加入几滴完全培养基。3周后可观察到肉眼可见的明显集落，0.05%结晶紫染色。

3统计学处理

结果

1SIRT6在肝癌病人及健康人外周血样本中的表达差异

将收集的外周血提取RNA后，采用RT-qPCR方法检测SIRT6的mRNA表达水平。统计学分析结果显示，在肝癌病人样本中，SIRT6的mRNA相对表达水平为7.3870±0.7245，癌旁组织中SIRT6的mRNA相对表达水平为1.0090±0.0746。SIRT6的mRNA表达水平在肝癌病人中显著高于正常人(P<0.01),见图1。随后，我们将肝癌病人的SIRT6的mRNA表达水平与多个临床病理参数相结合进行统计学分析。结果显示，SIRT6的表达量增高与肿瘤的大小、肿瘤的分级以及肿瘤的血管侵袭相关(P<0.01)。而与病人的性别、年龄以及肿瘤的分期、坏死、硬化不存在统计学上的相关性，见表1。

Figure 1.The mRNA expression levels of SIRT6 in the periphe-ral blood of HCC patients (n=200) and healthy persons (n=50) detected by RT-qPCR analysis.**P<0.01.

图1SIRT6在外周血中的mRNA表达水平

表 1SIRT6表达水平与肝细胞癌临床病理参数

Table 1.Correlation between SIRT6 expression and clinicopathologic parameters

2SIRT6在不同细胞系中的表达差异

提取原代肝细胞PHH、永生化肝细胞MIHA以及肝癌细胞SK-Hep-1、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Huh-7的总蛋白。Western blotting检测SIRT6的蛋白表达水平，结果显示SIRT6在肝癌细胞系中的表达水平明显高于原代肝细胞和永生化肝细胞，见图2。

3SIRT6沉默对肝癌细胞增殖的影响

我们首先在SK-Hep-1和Huh-7这2种肝癌细胞系中靶向沉默SIRT6的表达，Western blotting 检测沉默效率(图3)。结果显示，SK-Hep-1和Huh-7细胞中的沉默效率约为90%和80%。并以此为基础进行MTS实验，结果显示SIRT6沉默可显著抑制肝癌细胞的活力(P<0.01)，且随着天数的增加，抑制趋势更加明显，在第5 天时抑制率分别达到43%及42%，差异有统计学显著性(P<0.01)，见图4。

Figure 2.The protein expression levels of SIRT6 in primary he-patocytes, immortalized hepatocytes and 4 hepatoma cell lines.

图2SIRT6在细胞系中的蛋白表达水平

Figure 3.The silencing efficiency of shSIRT6 was analyzed by Western blotting analysis.

图3Western blotting检测shSIRT6的沉默效率

Figure 4.The effect ofSIRT6 silencing on the viability of HCC cells determined by MTS assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl.

图4MTS实验检测SIRT6沉默对肝癌细胞活力的影响

在SK-Hep-1细胞中靶向沉默SIRT6的表达，并进行EdU标记实验。结果显示SIRT6沉默组肝癌细胞的DNA合成能力明显减弱，说明沉默SIRT6可显著抑制肝癌细胞的DNA合成能力，抑制率达43%，见图5。结合MTS实验和EdU标记实验的一致变化，证实沉默SIRT6可显著抑制肝癌细胞的增殖。

4SIRT6沉默对肝癌细胞克隆形成能力的影响

在SK-Hep-1细胞中靶向沉默SIRT6的表达，以0.25 μmol/L嘌呤霉素处理，3周后0.1%结晶紫染色。结果显示沉默SIRT6组肝癌细胞形成的集落明显小于对照组，说明沉默SIRT6可显著抑制肝癌细胞的克隆形成能力，抑制率达50%,见图6。

Figure 5.The effect ofSIRT6 silencing on the DNA synthesis of HCC cells detected by EdU incorporation assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl.

图5EdU标记实验检测SIRT6沉默对肝癌细胞DNA合成能力的影响

Figure 6.The effect ofSIRT6 silencing on the ability of colony formation in HCC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl.

图6平板集落实验检测SIRT6沉默对肝癌细胞集落形成能力的影响

5SIRT6沉默对肝癌细胞锚定非依赖生长能力的影响

在SK-Hep-1细胞中靶向沉默SIRT6的表达，将2 000个细胞与琼脂糖凝胶混匀种入6孔板中，3周后0.05%结晶紫染色。结果显示沉默SIRT6组肝癌细胞形成的集落明显小于对照组，说明沉默SIRT6可显著抑制肝癌细胞的锚定非依赖生长能力，抑制率达53%(P<0.01)，见图7。

Figure 7.Effect ofSIRT6 silencing on the ability of anchorage-dependent growth in HCC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl.

图7软琼脂集落形成实验检测SIRT6沉默对肝癌细胞锚定非依赖生长能力的影响

讨论

SIRT6在肿瘤发生发展中的作用是具有争议的。有文献报道SIRT6促进了细胞因子的产生，并促使其迁移到胰腺癌细胞中，并发现SIRT6促进了炎症因子和趋化因子的表达，如IL-8和TNF-α，通过增强Ca2+反应，促进了细胞迁移[9]，且在皮肤癌[10]、前列腺癌[11]和乳腺癌[12]中，SIRT6的表达水平是异常增高的。在前列腺癌中，SIRT6基因沉默可以诱导前列腺癌细胞出现G1期细胞周期阻滞和细胞凋亡，并同时增加前列腺癌细胞对化疗药物的敏感性[11]。在乳腺癌病人中，SIRT6的表达上调使得乳腺癌病人对紫杉醇及表阿霉素耐药，并与病人预后不良相关[12]。这些研究结果揭示着SIRT6作为一种肿瘤促进因子发挥作用。而另一方面，胚胎成纤维细胞在SIRT6缺失的情况下可以不依赖于致癌基因而发生肿瘤，提示SIRT6可作为一种肿瘤抑癌因子。且SIRT6的缺失促进了肿瘤细胞的有氧糖酵解，使得肿瘤生长加快[13]。在神经胶质瘤中，SIRT6还可通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活而诱导细胞的凋亡并减少氧化应激，从而抑制肿瘤细胞的生长[14]。此外，SIRT6在人类头颈部癌和卵巢癌中的表达量异常降低[15-16]。综上所述，SIRT6在人类复杂的遗传背景下既可能是抑癌基因也可以是促癌基因。而目前有关SIRT6在肝细胞癌中的报道还很少。

在本研究中，我们从临床样本入手，分别检测了肝癌病人及健康人外周血中SIRT6的表达水平。结果显示其在肝癌病人外周血中的表达量显著增高，提示SIRT6可以作为肝癌诊断中新的标志物。且SIRT6的mRNA表达水平增高与肿瘤的大小、分级以及肿瘤的血管侵袭相关。提示其可以作为评价肝癌恶性程度的指标之一。进一步，我们发现SIRT6在多个肝癌细胞系中也呈现出高表达。沉默SIRT6可抑制细胞的增殖能力和DNA合成能力，并可抑制肝癌细胞的集落形成能力及锚定非依赖生长能力，说明SIRT6基因沉默后可抑制肝癌细胞的增殖及恶性转化。在SIRT6调控癌细胞增殖的分子机制研究进展中，有文献报道，在皮肤癌中SIRT6通过抑制AMPK信号通路促进COX-2的表达，从而促进皮肤癌细胞的增殖[10];而在卵巢癌中，SIRT6通过下调Notch3的表达从而抑制了卵巢癌细胞的增殖[16]。说明在不同的肿瘤类型中，SIRT6通过不同的机制发挥不同的作用。因此，我们也将继续研究在肝癌细胞中，SIRT6是通过何种机制发挥其促进细胞增殖及恶性转化的作用。综上所述，我们的结果突显出sirtuin家族在肝细胞癌增殖及恶性转化过程中的重要性，为癌症防治工作提供了有用的工具。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Effect of sirtuin 6 on proliferation of hepatocellular carcinoma cells

TAO Na-na, ZHOU Hong-zhong, REN Ji-hua, CHEN Xiang, LI Wan-yu, LIU Bo, CHEN Juan

(KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDiseases,MinistryofEducation,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:yixin_xinyuan@163.com)

[KEY WORDS]Sirtuin 6; Hepatocellular carcinoma; Cell proliferation

[ABSTRACT]AIM: To illuminate the effect of sirtuin 6 (SIRT6) on the proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC) cells. METHODS: The mRNA expression of SIRT6 in the peripheral blood from 200 cases of HCC patients and 50 cases of healthy people was detected by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). The mRNA expression levels of SIRT6 in the peripheral blood from 200 cases of HCC patients were combined with multiple clinicopathologic parameters for statistical analysis. The protein expression of SIRT6 in primary hepatocytes, immortalized hepatocytes and 4 hepatoma cell lines were determined by Western blotting. The silencing ofSIRT6 was conducted by transfection of vector expressing short hairpin RNA targeting onSIRT6, and the protein level of SIRT6 was measured by Western blotting. The viability of HCC cells was tested by MTS assay. DNA synthesis was analyzed by Cell-LightTMEdU Apollo®488InVitroImaging Kit. The abilities of colony formation and anchorage-dependent growth were measured by colony formation assay and soft agar assay, respectively. RESULTS: The mRNA expression of SIRT6 in the peripheral blood of HCC patients was significantly higher than that in the healthy people, and its expression was highly associated with tumor size, tumor grade and vascular invasion. SIRT6 expression in 4 hepatoma cell lines was significantly higher than that in the others.SIRT6 silencing led to a significant decrease in the cell viability as tested by MTS assay. EdU staining revealed thatSIRT6 silencing reduced DNA synthesis.SIRT6 silencing reduced the ability of colony formation and anchorage-dependent growth as determined by colony formation assay and soft agar assay, respectively. CONCLUSION: Sirtuin 6 promotes the proliferation and malignant transformation of HCC cells.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1031- 06

[收稿日期]2016- 01- 11[修回日期] 2016- 02- 24

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81472271)

通讯作者△Tel: 023-68486780; E-mail: yixin_xinyuan@163.com

[中图分类号]R735.7; R730.23

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.012