乙酰化修饰枸杞多糖及其抗氧化、抗肿瘤活性研究

彭天元，刘家水，颜红专

(1.安徽医科大学，安徽 合肥　230032；2.安庆医药高等专科学校，安徽 安庆　246052)



乙酰化修饰枸杞多糖及其抗氧化、抗肿瘤活性研究

彭天元1，刘家水2，颜红专2

(1.安徽医科大学，安徽 合肥230032；2.安庆医药高等专科学校，安徽 安庆246052)

[摘要]目的观察分子结构乙酰化修饰对枸杞多糖(Lycium barbarum L.polysaccharide，LBP)体内抗氧化、抗肿瘤活性的影响。方法通过分子结构乙酰化修饰得到枸杞多糖乙酰化衍生物LBPa；将昆明种小鼠随机分成空白对照组，阳性对照组(维生素C)，LBP高、低剂量组及LBPa高、低剂量组，测定小鼠血清和肝脏丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肝脏总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和过氧化氢酶(catalase，CAT)。复制H22荷瘤小鼠模型，灌胃给药LBP，考察LBPa和LBP对肿瘤细胞抑制率、脾脏指数、胸腺指数及血清肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素-2(interleukin，IL-2)含量的影响。结果LBPa可以显著提高正常小鼠肝组织CAT活力及T-AOC，降低小鼠血清及肝脏MDA含量，其抗氧化效果优于维生素C及LBP，LBPa及LBP抗氧化活性均与剂量具有正相关性。LBPa可显著抑制H22肿瘤细胞增殖，提高免疫器官指数，提高血清IL-2及TNF-α含量；除IL-2含量外，对其他指标的影响均有剂量依赖性；LBPa抗肿瘤活性明显优于LBP。结论乙酰化修饰可显著提高LBP的抗氧化及抗肿瘤活性。

[关键词]枸杞多糖；乙酰化修饰；抗氧化；抗肿瘤

枸杞多糖(LyciumbarbarumL.polysaccharide，LBP)，存在于茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.干燥成熟果实中[1-2]。大量研究表明LBP具有抗肿瘤[3]、降血糖[4]、抗氧化[5]及抗溃疡[6]等活性。

天然来源的多糖具有低毒、无不良反应的优势，但也存在一些不足：①有些天然多糖并不具有生物学活性[7]；②有些多糖因为其理化性质或空间结构等问题，限制了其药理活性；③一些多糖生物学活性较弱，还需要进一步改善[8]。目前国内外已有大量文献报道关于分子修饰多糖从而获得理想的活性多糖。分子修饰方法主要分为化学修饰、物理修饰及生物修饰，其中化学修饰运用最广。化学修饰方法主要通过嫁接其他基团或者元素，以达到多糖改性的目的[9]。研究指出分子修饰后的多糖不仅可以提高原有的生物学活性，有些甚至可以产生新的药理作用。例如天然茯苓多糖仅有良好的免疫调节作用，但经硫酸酯化后具有显著的抗S180肿瘤活性[10]。纤维素因不溶于水，对其分子直接修饰难度较大，首先需乙酰化修饰以增加其溶解性，之后再进行硫酸酯化修饰，得到的乙酰化-硫酸酯化纤维素具有显著的抗HIV活性[11]。然而对于LBP乙酰化修饰尚无研究报道，从其他关于多糖乙酰化的研究报道可以推测，乙酰化可使多糖改变定向性及横向次序，从而改变多糖的空间排布，增加其水溶性，改善其活性。因此本研究采用乙酰化修饰LBP得到其乙酰化衍生物LBPa，通过体内抗氧化实验检测LBPa抗氧化及抗肿瘤活性，为LBP相关药品及功能保健品的开发奠定理论基础。

1材料与仪器

1.1试药与试剂LBP：实验室自制，经水提醇沉法[12]获得粗多糖后采用Superdex-G 200分离得到纯化LBP，Sevag法测得多糖纯度为97.3%；过氧化氢酶(catalase，CAT)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒：南京建成生物工程研究所；三氯乙酸、吡啶、甲酰胺、乙酸酐、无水乙醇均为分析纯。

1.2实验动物SPF级KM小鼠及SD大鼠，中科院上海动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK(沪)2003-0003，体质量分别为(20±2)g及(220±20)g。

1.3仪器DL-5000B离心机：上海飞鸽科学仪器厂；RE52-4旋转蒸发仪：江苏省常州金坛仪器有限公司；FA2004电子天平：上海菁华仪器有限公司；501型恒温水浴锅：上海实验仪器厂有限公司；UV-360紫外可见分光光度计：日本岛津公司。

2方法

2.1LBP乙酰化衍生物制备按文献[13]方法，称取400 mg LBP溶于10 mL蒸馏水中，充分溶解，用NaOH调节溶液pH值至9.0，然后缓慢滴加5 mL甲酰胺，同时滴加NaOH溶液以维持反应体系的pH值在8.0～8.4之间，反应过程中持续搅拌，反应结束后滴加盐酸至溶液呈中性，乙醇沉淀反应体系，沉淀物用95%乙醇洗涤，冷冻干燥后溶于100 mL去蒸馏水中，3 000 Da透析袋透析72 h，浓缩，醇沉，冷冻干燥即得LBP乙酰化衍生物LBPa。采用IR检测乙酰化成功与否[13]。

2.2LBPa对正常小鼠抗氧化能力的影响将60只KM小鼠随机分成6组，雌雄各半。分别为空白对照组(每天灌胃0.9%生理盐水)、阳性对照组(维生素C 500 mg/kg，用前新鲜配制)、LBP低剂量组(100 mg/kg)、LBP高剂量组(300 mg/kg)、LBPa低剂量组(100 mg/kg)和LBPa高剂量组(300 mg/kg)。连续灌胃给药15 d，末次给药后眼眶取血，收集后离心取血清。麻醉处死小鼠，剖取肝脏，按试剂盒指导方法检测小鼠血清和肝脏MDA、肝脏T-AOC和肝脏CAT。

2.3LBPa体内抑制H22肿瘤细胞增殖作用从H22荷瘤小鼠腹腔中抽取瘤液，生理盐水调节细胞密度至1×106/mL，台酚蓝染色，镜检，细胞存活率不小于95%。取无菌洁净级BALB/c雄性小鼠(20±2)g，右腹股沟皮下植入0.1 mL瘤细胞悬液。接种后，小鼠自由饮食。24 h后，将小鼠随机分为模型组(0.9% NaCl)，阳性对照组(环磷酰胺，30 mg/kg)，LBP及LBPa高、低剂量组(分别为300、100 mg/kg)，每组各10只。每天灌胃给药1次相应药物，10 d后称质量，处死小鼠，各组小鼠眼眶静脉丛取血，离心，分离血清，按试剂盒说明书指导操作，计算血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素-2(interleukin，IL-2)含量。同时称量肿瘤、脾脏及胸腺质量。计算肿瘤抑制率、脾脏指数及胸腺指数。

式中Wc为对照组平均肿瘤质量，Wt为实验组平均肿瘤质量。

3结果

3.2LBPa对正常小鼠抗氧化能力的影响MDA是细胞导致脂质过氧化的代谢产物，因此MDA浓度越低，则脂质过氧化程度越低，表明机体抗氧化能力就越强[14]。CAT可促使体内积聚的H2O2分解为氧和水，从而使细胞免于H2O2的氧化损伤[15]。

空白对照组，阳性对照组，LBPa高、低剂量组血清MDA、肝脏MDA、肝脏T-AOC和肝脏CAT活力比较，差异均具有统计学意义(血清MDA：F(3，36)=72.80，P=0.000；肝脏MDA：F(3，36)=151.07，P=0.000；肝脏T-AOC：F(3，36)=89.94，P=0.000；肝脏CAT：F(3，36)=103.76，P=0.000)，LBPa高、低剂量组血清和肝脏MDA水平显著低于阳性对照组和空白对照组(P<0.05)，而肝脏T-AOC和肝脏CAT活力显著高于阳性对照组和空白对照组(P<0.05)。结果说明LBPa在提高正常小鼠抗氧化能力方面明显优于阳性对照药维生素C。见表1。

表1　LBPa对正常小鼠抗氧化能力的影响±s)

注：同列具有不同右上标符号的组别比较，P<0.05。

3.3乙酰化修饰因素和剂量因素对正常小鼠抗氧化能力的影响两因素方差分析结果显示，乙酰化修饰因素和剂量因素对血清MDA、肝脏MDA、肝脏T-AOC和肝脏CAT活力的主效应均具有统计学意义(P<0.05)，两者的交互作用均无统计学意义(P>0.05)，见表2。简单效应分析结果显示，对于同一剂量，LBPa降低血清和肝脏MDA及升高肝脏T-AOC和CAT活力的效应优于LBP；对于LBP或LBPa，高剂量的效应均优于低剂量。结果提示，在提高正常小鼠抗氧化能力方面，乙酰化修饰的LBP的效应优于未修饰的效应，高剂量的效应优于低剂量的效应。见表3。

表2　乙酰化修饰因素和剂量因素对正常小鼠抗氧化能力影响的两因素方差分析结果

3.4LBPa对H22肿瘤细胞增殖活性及其对血清TNF-α及IL-2含量的影响LBPa高、低剂量组肿瘤抑制率均低于阳性对照组，脾脏指数和胸腺指数均高于阳性对照组(P<0.05)，LBPa高、低剂量组之间脾脏指数和胸腺指数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结果提示环磷酰胺虽然抗肿瘤活性较强，但对免疫器官具有显著的抑制作用。LBPa高、低剂量组和阳性对照组血清TNF-α和IL-2水平较模型组显著升高(P<0.05)，且LBPa高、低剂量组血清IL-2水平显著低于阳性对照组(P<0.05)。见表4。

表3　不同剂量LBP和LBPa对正常小鼠抗氧化能力的影响±s)

注：与LBP低剂量组比较，*P<0.05；与LBPa低剂量组比较，#P<0.05；与LBP高剂量组比较，△P<0.05。

表4　LBPa对H22荷瘤小鼠肿瘤抑制率、脾脏指数、胸腺指数及血清TNF-α、IL-2水平的影响±s)

注：同列具有相同右上标符号的组别比较，P>0.05；同列具有不同右上标符号的组别比较，P<0.05。

3.5乙酰化修饰因素和剂量因素对H22肿瘤细胞增殖活性及其对血清TNF-α及IL-2含量的影响两因素方差分析结果显示，乙酰化修饰因素和剂量因素对脾脏指数、胸腺指数和血清TNF-α的主效应均具有统计学意义(P<0.05)，乙酰化修饰因素对血清IL-2的主效应具有统计学意义(P<0.05)，两者的交互作用均无统计学意义(P>0.05)，见表5。简单效应分析结果显示，相同剂量的LBPa对肿瘤的抑制作用高于相同剂量的LBP，血清TNF-α水平明显高于相同剂量的LBP(P<0.05)，而对脾脏和胸腺的抑制作用均明显低于相同剂量的LBP(P<0.05)，见表6。结果提示，乙酰化修饰的LBP抑制肿瘤的效应及升高血清TNF-α和IL-2的效应明显优于未修饰的LBP，其抑制免疫器官的效应明显低于未修饰的LBP，在保护脾脏和胸腺，升高血清TNF-α方面具有明显的剂量依赖性，在升高血清IL-2方面无明显的量效关系。

4讨论

机体绝大部分病变与体内抗氧化能力衰退有关，当机体不能及时清理体内过氧化物时，则会导致细胞损伤，进而导致机体受损、病变。本研究结果表明，LBP及LBPa均能提高机体抗氧化活力，且经乙酰化修饰的LBPa抗氧化活性优于未经修饰的天然的LBP，表明乙酰化修饰可以提高LBP的抗氧化活性。此外胸腺通过产生T淋巴细胞以及胸腺素发挥免疫作用，脾脏与体液免疫关系密切，因此LBPa及LBP抗肿瘤活性机制之一可能为其能够提升机体免疫器官作用从而发挥抗肿瘤活性；另外，LBP及LBPa可使H22荷瘤小鼠血清IL-2及TNF-α的含量增加，TNF-α可直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性，而IL-2通过调节机体的免疫系统发挥抗癌活性[16]，且LBPa活性更优。

表6　不同剂量LBP和LBPa对H22肿瘤细胞增殖活性及其对血清TNF-α及IL-2含量的影响±s)

注：与LBP低剂量组比较，*P<0.05；与LBPa低剂量组比较，#P<0.05；与LBP高剂量组比较，△P<0.05。

以上结果表明，LBP乙酰化衍生物的抗氧化及抗肿瘤活性均显著优于未经修饰的天然LBP。其原因可能是乙酰化修饰改变LBP的定向性及横向次序，因而改变其空间排布，增加其亲水性，有利于药物吸收，从而提高了LBP活性。

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Acetylation ofLyciumbarbarumL. Polysaccharide and Its Antioxidant and Antitumor Activities

PENGTian-yuan1,LIUJia-shui2,YANHong-zhuan2

(1.AnhuiMedicalUniversity,AnhuiHefei230032,China; 2.AnqingMedicalandPharmaceuticalCollege,AnhuiAnqing246052,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the influence of acetylation on the in vivo antioxidant and antitumor activities of Lycium barbarum L. polysaccharide (LBP). MethodsLBPa, the acetyl derivative of LBP, was obtained through acetylation. Kunming mice were randomly divided into blank control group, positive control group (vitamin C), low- and high-dose LBP groups, and low- and high-dose LBPa groups, and serum and liver malondialdehyde (MDA), total antioxidant capacity (T-AOC) of the liver, and catalase (CAT) were determined. A H22 tumor-bearing mouse model was established, and these mice were given LBP by gavage. The influence of LBPa and LBP on the inhibition rate of tumor cells, spleen index, thymus index, and serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-2 (IL-2) was observed. ResultsLBPa significantly improved liver CAT activity and T-AOC in normal mice and reduced the content of serum and liver MDA, achieving a better antioxidant effect than vitamin C and LBP; the antioxidant activity of LBP and LBPa was positively correlated with their doses. LBPa significantly inhibited the proliferation of H22 tumor cells, improved the immune organ index, and increased the serum levels of IL-2 and TNF-α; the influence on all indices except IL-2 was dose-dependent; LBPa had a better antitumor activity than LBP. ConclusionAcetylation can significantly improve the antioxidant and antitumor activities of LBP.

[Key words]Ganoderma lucidum L. polysaccharide; acetylation; antioxidant; antitumor

收稿日期：(2015-07-20；编辑：姚实林)

通信作者：颜红专，yan1hz@163.com

作者简介：彭天元(1990-)，男，硕士研究生

基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(20113420120001)

[中图分类号]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.020