平喘宁对哮喘大鼠肺组织MEK1、MEK2、Ras mRNA表达的影响

方向明，朱佳琪，邬锡琴

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥　230038；2.合肥工业大学，安徽 合肥　230009)



平喘宁对哮喘大鼠肺组织MEK1、MEK2、Ras mRNA表达的影响

方向明1，朱佳琪1，邬锡琴2

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥230038；2.合肥工业大学，安徽 合肥230009)

[摘要]目的观察平喘宁对寒性哮喘大鼠气道形态学及肺组织中丝裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)1 mRNA、MEK2 mRNA及Ras mRNA表达水平的影响。方法将105只雄性SD大鼠随机分为正常组，模型组，桂龙咳喘宁组，地塞米松组，平喘宁高、中、低剂量组，每组15只。以卵蛋白致敏及寒冷刺激复制大鼠哮喘模型，模型复制21 d后，分别给予地塞米松组，桂龙咳喘宁组，平喘宁高、中、低剂量组大鼠相应药物灌胃，给予正常组和模型组大鼠等容量蒸馏水灌胃。4周后取出肺组织，采用苏木精-伊红染色行病理形态学观察，采用逆转录-聚合酶链式反应半定量检测MEK1 mRNA、MEK2 mRNA及Ras mRNA表达水平。结果与正常组比较，模型组发生明显炎性细胞浸润，气道平滑肌增厚；MEK1 mRNA、MEK2 mRNA以及Ras mRNA表达水平显著増高(P<0.05)。与模型组比较，地塞米松组、桂龙咳喘宁组、平喘宁组大鼠肺组织病理改变减轻；各治疗组MEK1 mRNA、MEK2 mRNA以及Ras mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。结论平喘宁可明显减轻哮喘大鼠的气道炎性反应，抑制哮喘大鼠肺组织中MEK1 mRNA、MEK2 mRNA以及Ras mRNA的表达，延缓气道重塑而治疗哮喘。

[关键词]哮喘；平喘宁；MEK1；MEK2；Ras

支气管哮喘是一种多种炎性细胞和细胞因子参与调节的复杂慢性炎症过程，进而造成了气道的高反应性和炎性阻塞病变[1]。气道重塑是哮喘的重要病理特征，其与气道高反应性是互相促进的，共同诱导哮喘的发病和加重。细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族中的一个亚族，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生理病理过程，作为一个重要的第二信号转导通路影响气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells， ASMCs)的增殖。平喘宁是具有温肺化痰、止咳平喘主要功效的临床验方。本实验通过采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，测定平喘宁干预前后哮喘大鼠肺脏ERK信号通路中丝裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)1、MEK2和Ras mRNA的表达水平，探讨平喘宁治疗寒性哮喘的分子机制。

1材料

1.1动物雄性SD大鼠105只，体质量180~220 g，清洁级，由安徽医科大学实验动物管理中心提供，动物生产许可证号：SCXK(皖)2011-002。

1.2药物及试剂平喘宁方药组成：麻黄、苏子、杏仁、半夏等，方药购于安徽中医药大学第一附属医院中药房，将中药饮片加水煎煮，制成高剂量(4.2 g/mL)、中剂量(2.1 g/mL)、低剂量(1.05 g/mL)的平喘宁煎剂；桂龙咳喘宁颗粒剂(批号 Z20103119)：山西桂龙医药有限公司产品；地塞米松片(批号 030402)：上海信谊药业有限公司产品。卵蛋白(ovalbumin，OVA)(批号 20140228)：美国Sigma公司；Trizol试剂(批号 14105)：美国Invitrogen公司；目的基因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物(批号 20140721)：上海捷瑞生物技术有限公司；PCR试剂和Taq DNA聚合酶(批号 00255866)：美国Fermentas公司；琼脂糖凝胶(批号 111860)：北京索莱宝科技有限公司；焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)(批号 20130119215)：美国Sigma公司；逆转录试剂盒(批号 00145205)：Fermentas公司；DNA Marker(批号 B7301A)：宝生物公司。

1.3主要仪器9700型PCR仪：美国ABI公司；TGL-18R冷冻离心机：江苏捷达公司；Eagle EyeⅡ凝胶成像仪：AGENE公司；FA3204B型电子天平：上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂；402A型超声雾化器：江苏鱼跃医疗设备有限公司；CX31型光学显微镜：日本奥林巴斯公司；GSG-2000病理图像分析系统：珠海黑马医学仪器有限公司。

2方法

2.1动物分组与模型制备取健康SD大鼠105只，常规饲养7 d后，随机分组为7组，每组15只，即正常组，模型组，平喘宁高、中、低剂量组，地塞米松组，桂龙咳喘宁组。参照文献[2-4]复制寒哮模型。正常组参照上述方法，但致敏与激发时均以生理盐水代替OVA，不用寒冷刺激。以大鼠出现畏寒肢冷、呼吸急促、腹肌抽搐、口唇发绀代表模型复制成功。模型复制成功后，继续雾化激发与寒冷刺激4周。

2.2给药方法模型复制第21天后开始给药。给予正常组、模型组大鼠灌胃等容积的蒸馏水；对于桂龙咳喘宁组大鼠，将桂龙咳喘宁胶囊内药粉倒出用蒸馏水溶解后灌服(每日10 g/kg)；对于地塞米松组大鼠，将地塞米松药片研碎后用蒸馏水溶解后灌服(每日0.4 mg/kg)；对于平喘宁高、中、低剂量组大鼠，分别给予平喘宁灌服(每日19.6、9.8、4.9 g/kg)，每日1次，连续给药4周。末次激发后1~2 h，用3%戊巴比妥钠作腹腔注射麻醉，取大鼠左右肺分别置于10%甲醛液中固定及―80 ℃冰箱中保存备用。

2.3观察指标及检测方法

2.3.1肺组织的苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色取左上肺，修剪组织，最大限度地暴露较多的支气管切面，切片，常规HE染色，OLYMPUS显微镜下观察并摄片，光镜下观察HE染色切片的肺组织形态学改变。

2.3.2MEK1 mRNA、MEK2 mRNA及Ras mRNA的测定引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。MEK1扩增产物长度：295 bP；其正向引物：5′-TCGGATTGGCTCGGGCTCCT-3′，其反向引物：5′-TCTGGGGCCATCCACAGCAC-3′。MEK2扩增产物长度：680 bP；其正向引物：5′-TGGTGGACCGCAACAACGCAAT-3′；其反向引物：5′-TGGGGGTCAGCAGCCGGTTAGG-3′。Ras扩增产物长度：442 bP；其正向引物：5′-TCGGATTGGCTCGGGCTCCT-3′；其反向引物：5′-ACGCTCCAAGCGGTAGGTTGA-3′。GAPDH扩增产物长度：150 bP；其正向引物：5′-CTTGCAGGCAGGTCGGTGGGT-3′；其反向引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。

(1)RNA的提取取100 mg肺组织放于匀浆管内，冰上操作，参照文献[4]进行RNA的提取，将提取的总RNA保存于-80 ℃超低温冰箱中。取8 μL总RNA点样于0.8%琼脂糖凝胶电泳，Eagle EyeⅡ凝胶成像仪观察电泳条带，并用DU640紫外分光光度计测算RNA的OD260/OD280。结果显示各组总RNA的平均OD260/OD280值为1.8～2.0，表明总RNA基本无蛋白质污染与降解，RNA纯度较好。

(2)RT反应在0.2 mL EP管中，加入总RNA 8 μL、10 μmol/L Oligo(dT)1 μL和DEPC水4 μL，轻轻混匀，点动离心。PCR仪上65 ℃加热5 min，冰浴3 min，在上述管中加入莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(moloney murine leukemia virus reverse transcription，MMLVRT)1.0 μL、10 mmol/L dNTPs 2.0 μL、胸腺嘧啶组成的核苷酸链(Oligo(dt)primer )1.0 μL、5倍反应缓冲液1.0 μL、RNA酶抑制剂1 μL、RNA 2 μL、水、无核酸酶水9 μL，混匀后点动离心，在PCR仪器上进行下述操作：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，取出上述反应液，即为cDNA，-20 ℃保存。PCR反应：吸取上述反应液5 μL作为模板，加入到PCR反应管中。反应条件：MEK1变性30 s，95 ℃；退火51 ℃，30 s；72 ℃延伸，1 min；共进行30个循环，最后72 ℃延伸5 min，扩增长度片段296 bP。Ras变性30 s，95 ℃；退火51 ℃，30 s；72 ℃延伸，1 min；共进行35个循环，最后72 ℃延伸5 min，扩增长度片段442 bP。MEK2变性30 s，95 ℃；退火50 ℃，30 s；72 ℃延伸，1 min；共进行35个循环，最后72 ℃延伸5 min，扩增长度片段680 bP。内参GAPDH变性30 s，94 ℃；退火53 ℃，30 s；72 ℃延伸1 min；共进行30个循环，最后72 ℃延伸5 min，扩增长度片段150 bP。

(3)PCR产物电泳分析分别取5 μL PCR产物与1 μL DNA加样缓冲液混匀，以1%琼脂糖凝胶电泳，同时加150 bp Marker作对照标记，其结果用Eagle EyeⅡ凝胶成像仪进行产物位置、光密度值扫描(密度代表基因表达丰度)分析。

3结果

3.1各组大鼠肺组织病理形态学比较正常组大鼠支气管、肺组织结构正常，无炎性细胞浸润，气道平滑肌无增厚。模型组支气管明显炎性细胞浸润，上皮细胞脱落，各级支气管管壁及平滑肌层和基膜增厚，管道变窄，尤以细支气管显著。各治疗组相对于模型组气管周围炎性细胞浸润减少，气道上皮细胞脱落减少，气道平滑肌增厚减轻。其中平喘宁高剂量组炎性细胞浸润、平滑肌增厚等病理改善最为明显。见图1。

3.2各组大鼠肺组织MEK1、MEK2和Ras mRNA相对表达水平比较与正常组比较，模型组MEK1、MEK2和Ras mRNA相对表达水平明显增高(P<0.05)。与模型组相比，平喘宁低、中、高剂量组MEK1、MEK2和Ras mRNA相对表达水平均显著降低(P<0.05)，呈现明显的量效关系，以平喘宁高剂量组MEK1、MEK2和Ras mRNA相对表达水平为最低。平喘宁高、中、低剂量组MEK1、MEK2和Ras mRNA相对表达水平显著低于地塞米松组和桂龙咳喘宁组(P<0.05)。见表1、图2。

表1　各组大鼠肺组织MEK1、MEK2和Ras mRNA相对表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与地塞米松组比较，△P<0.05；与桂龙咳喘宁组比较，◇P<0.05。

注：M. Marker；A.正常组；B.模型组；C.桂龙咳喘宁组；D.地塞米松组；E.平喘宁高剂量组；F.平喘宁中剂量组；G.平喘宁低剂量组。

4讨论

支气管哮喘是一种世界范围内高发的呼吸道慢性炎症，气道重塑是哮喘的重要病理特征。气道重塑组织形态学特征包括淋巴细胞的浸润，上皮下纤维化等[1]。嗜酸性粒细胞﹑肥大细胞等炎性细胞的大量浸润是造成哮喘慢性炎症的关键。近年来，细胞内信号转导通路在哮喘慢性气道炎症发生的作用日益被重视。

MAPK是参与哮喘发病的一条重要受体信号转导通路[5]，尤其是气道平滑肌增殖中发挥重要作用，其中Ras-Raf-MEK-ERK途径是迄今研究比较清楚的MAPKs家族成员之一。Ras是小G蛋白，作为信号开关分子调节细胞的生长和分化，可以激活在哮喘气道重塑中作为启动基因异二聚体蛋白AP-1[6]。MEK是ERK通路的关键蛋白，存在MEK1和MEK2两种亚型，表示为MEK1/2。MEK1和MEK2在激酶功能域中有80%氨基酸组成相似，共同维持下游ERK1/2的活化﹑调控细胞周期[2]，在哮喘的气道重塑形成中起着关键性作用。在哮喘的发生发展中，ASMCs的大量增殖是不可避免的，而其增殖依赖于ERK通路的活化。因此抑制ERK通路的激活，是治疗哮喘的新型视角。

本研究的模型复制方法在前期实验中已多次被应用，并检测过肺功能指标，证实此种方法可以复制哮喘模型。此实验是前期系列研究的延续，有关平喘指标在前期已有观察，因此，此实验不再观察。平喘宁由经方射干麻黄汤与三子养亲汤化裁而成，是笔者长期治疗寒哮的验方，主要由麻黄、苏子、杏仁、半夏等中药组成，功效温肺散寒、止咳平喘。研究表明，气道内炎性细胞和炎性递质的凋亡是减轻慢性气道炎症的一个关键机制，炎性细胞的凋亡对炎症的消退以及阻止哮喘的发展起着推动作用[7]。平喘宁具有一定抗炎作用，可以减轻炎性反应，抑制气道重塑，从根本防治哮喘。

本实验显示，平喘宁可以通过调节ERK信号转导通路，抑制MEK1 mRNA、MEK2 mRNA以及Ras mRNA表达，从而抑制哮喘大鼠气道炎性细胞浸润，延缓抑制气道重塑而治疗哮喘，此实验表明ERK信号转导通路在中医药治疗哮喘中起重要作用，下一步将深入探讨平喘宁调节ERK信号转导通路治疗哮喘的路径与机制。

参考文献:

[1]史锁芳，刘丽，黄辉，等.祛风宣痹方对哮喘豚鼠p38MAPK信号通路的影响[J].中华中医药杂志，2012，27(9):2441-2443.

[2]白晶，刘先胜，徐永健，等.细胞外信号调节蛋白激酶对哮喘大鼠气道平滑肌细胞周期的影响[J].中国呼吸与危重监护杂志，2010，9(1):23-27.

[3]王鹏，文小敏，赵鸿云，等.肺阳虚证的实验研究[J].湖北中医杂志，1998，20(4):53-55.

[4]方向明，胡谦，袁亚美，等.平喘宁对哮喘大鼠肺组织Raf mRNA、ERK1 mRNA表达的影响[J].中华中医药杂志，2014，29(1)：76-81.

[5]张爱芝，张焕萍，蔺鹏翔. ERK活化对哮喘大鼠气道重塑及Cyclin D1表达的影响[J].中国比较医学杂志，2010，20(3):26-29.

[6]陈建勇，王聪，王娟，等.MAPK信号通路研究进展[J].中国医药科学，2011，1(8):32-33.

[7]易婷，张浩，彭宜红，等.MEK1-ERKs级联方式是调控单纯疱疹病毒Ⅱ型复制的重要机制[J].中国生物化学与分子生物学报，2011，27(2):142-147.

·实验研究·

Effect of Pingchuanning on mRNA Expression of MEK1, MEK2, and Ras in Lung Tissues from Asthmatic Rats

FANGXiang-ming1,ZHUJia-qi1,WUXi-qin2

(1.AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.HefeiUniversityofTechnology,AnhuiHefei230009,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of Pingchuanning on airway morphology and the mRNA expression of mitogen-activated protein kinase kinase 1 (MEK1), mitogen-activated protein kinase kinase 2 (MEK2), and Ras in the lung tissues of rats with cold-type asthma. MethodsOne hundred and five male Sprague-Dawley rats were randomized into normal group, model group, Guilongkechuanning group, dexamethasone group, and high-, medium-, and low-dose Pingchuanning groups, with 15 rats in each group. A rat model of asthma was established through ovalbumin sensitization and cold stimulation; 21 days later, the rats in the dexamethasone group, the Guilongkechuanning group, and the high-, medium-, and low-dose Pingchuanning groups were given respective drugs by gavage, and those in the normal group and the model group were given an equal volume of distilled water by gavage. The lung tissues were collected 4 weeks later, and hematoxylin and eosin staining was applied to observe the pathomorphological changes. Reverse transcription-polymerase chain reaction was applied for semiquantitative determination of mRNA expression levels of MEK1, MEK2, and Ras. ResultsCompared with the normal group, the model group had obvious inflammatory cell infiltration and airway smooth muscle thickening and significantly higher mRNA expression levels of MEK1, MEK2, and Ras (P<0.05). Compared with the model group, the dexamethasone group, the Guilongkechuanning group, and the Pingchuanning groups had fewer histopathological changes in lung tissues; each treatment group had significantly reduced mRNA expression levels of MEK1, MEK2, and Ras after treatment (P<0.05). ConclusionPingchuanning can alleviate the airway inflammatory response, inhibit the mRNA expression of MEK1, MEK2, and Ras, delay airway remodeling, and thus reach the purpose of treating asthma.

[Key words]asthma; Pingchuanning; MEK1; MEK2;Ras

收稿日期：(2015-06-26；编辑：曹健)

作者简介：方向明(1968-)，男，博士，教授

基金项目：国家自然科学基金项目(81173187)

[中图分类号]R562.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.019