布病患者血清microRNA-146a表达及其与抗体滴度的关系研究①

于玖轩　徐晓阳　雷霜霜　陈泽良　王季秋　王大力　郑源强　石艳春

(内蒙古医科大学自治区分子生物学重点实验室，呼和浩特010058)

布病患者血清microRNA-146a表达及其与抗体滴度的关系研究①

于玖轩徐晓阳②雷霜霜②陈泽良②王季秋③王大力③郑源强石艳春

(内蒙古医科大学自治区分子生物学重点实验室，呼和浩特010058)

①本文为国家“十二五”科技支撑计划项目(2014BAI13B03)、国家自然科学基金项目(81171530、31272592、81401646、81460248、81260457)、内蒙古自治区科技重大专项、内蒙古自治区自然科学基金(2013MS1138、2012MS1121、2015MS0820)、内蒙古自治区科技计划项目(20120101、20120402、20110501)、内蒙古自治区卫计委医疗卫生科研计划项目(201301035、2010018)、内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZY109)资助。

②军事医学科学院疾病预防控制所，北京100071。

③中国疾病预防控制中心鼠疫布病防治基地，白城137000。

石艳春(1958年-)，女，博士，教授，主要从事抗感染免疫与疫苗研究，E-mail:ycshi5388@163.com。

[摘要]目的：研究microRNA-146a在布病患者血清中表达规律及其与血清滴度的关系。方法：采用定量PCR方法，测定布病患者和健康人血清中miR-146a的表达，并分析表达水平与血清抗体水平、就诊时间等彼此的相关性。结果：利用阳性参考品建立了miR-146a定量检测工作曲线，对20例布病阳性病例和20例正常人血清miR-146a进行了检测，布病患者血清中miR-146a显著低于正常人(P<0.001)，miR-146a的水平与血清抗体滴度呈负相关(P<0.05)。结论：布鲁氏菌感染后患者血清中miR-146a表达被抑制，并且患者血清抗体滴度越高，抑制程度越高。

[关键词]microRNA-146a；布病；血清抗体滴度

布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是由布氏菌入侵机体引起的全球广泛流行的人畜共患病。近年来布病在全球的发病率有上升趋势，部分国家和地区的发病率超过万分之一，已被确定为再发性传染病[1]。布病的传播方式主要是人类通过接触受感染的动物、摄入未经高温消毒的奶制品以及食用受感染牲畜的肉制品等[2]。

动物布病主要表现为流产和附睾炎，人类感染布氏菌可出现典型的临床表现如发热、出汗、寒战、头痛、不适、肌痛和关节痛[3]。布病按疾病阶段可分为急性、亚急性、慢性；按疾病的表现分为复发、活跃及不活跃。上世纪90年代以来，我国布病的发病率呈明显上升趋势。布病的发病特点是一旦发病并转入慢性就难以根治，临床治疗上使用抗生素的方法也常失效或导致复发，严重威胁着人民群众的生命健康与安全，已成为一个重要的公共安全卫生问题。了解布病的致病与免疫机制，对于预防该病具有重要意义。

MicroRNA(miRNA)是一种存在于动植物体内，长度为18~22nt的内源性非编码单链小分子RNA，主要在转录后水平对基因表达进行调节。在人类基因组中，miRNA占所有基因的 1%~5%，但却能够调节30%蛋白编码基因的表达[4]，形成复杂的调控网络。近年来研究者已证实miRNA在宿主和细菌之间起到重要的关联作用[5]。其中miRNA-146a(miR-146a)是首个被发现具有免疫调节作用的miRNA，广泛参与了多种炎症及自身免疫性疾病等免疫反应相关疾病的发生过程[6,7]。但是，miR-146a在人布病中的具体表达变化及其临床病理意义尚不清楚。本研究旨在研究miR-146a在布病患者体内表达规律，为探寻布病发病机理及针对性治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1资料与试剂于2015年5月~2015年6月期间在布病门诊收集的布病患者全血和血清样本。对照组为健康体检者。通用探针法定量PCR引物包括：Uni-RT逆转录引物(5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT CAG AGC CAC CTG GGC AAT TTT TTT TTT TVN-3′)、Uni-R(5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′)、Uni-P(5′-FAM CAG AGC CAC CTG GGC AAT T BHQ-3′)。TaKaRa Taq(rTaq DNA Polymer-ase)、探针法定量PCR试剂盒购自宝生生物工程(大连)有限公司；Trizol Reagent购自美国Ambion公司；人miR-146a上游引物(5′-TGA GAA CTG AAT TCC ATG GGT T-3′)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；人工合成的人miR-146a模拟物(5′-UGA GAA CUG AAU UCC AUG GGUU-3′)购自上海吉玛制药技术有限公司；miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1总RNA的提取及逆转录将全血样本室温7 340 r/min离心3 min，取上层血浆使用Trizol法提取总RNA：加入1 ml Trizol试剂，振荡器充分振荡，置10 min。加入约200 μl的三氯甲烷，上下颠倒充分混匀1 min左右，室温静置5 min。4℃,11 372 r/min离心30 min，取水相转入新的1.5 ml 离心管，加入等体积的异丙醇颠倒混匀，4℃放置1 h。取出后将样本4℃，11 372 r/min离心30 min去上清，向沉淀中加入1 ml 75%乙醇，4℃，11 372 r/min离心洗涤沉淀10 min，重复3遍。去上清，沉淀室温晾干后加入DEPC水充分溶解。测RNA浓度，测定OD260/OD280值。逆转录过程严格按照miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书实施。将合成的cDNA置于-20℃保存。

1.2.2qRT-PCR体系及反应参数TaKaRa rTaq DNA Polymerase 0.2 μl，10×PCR Buffer 1 μl ，dNTP Mixture 0.8 μl，cDNA 0.2 μl，上游引物0.2 μl，下游引物 0.2 μl，探针0.2 μl，RNase free H2O 7.2 μl。按如下条件进行PCR反应：预变性95℃ 2 min，变性95℃ 10 s，退火延伸60℃ 30 s，扩增40个循环。每个样本独立重复实验 3 次。

1.2.3microRNA-146a标准曲线的建立将工作浓度20 μmol/L的人microRNA-146a模拟物作为标准品，测定OD 值，按miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒将得到的已知浓度RNA标准品进行逆转录，之后将 cDNA 进行10倍系列稀释，作为模板进行Real-time PCR扩增，根据扩增Ct值及其标准品含量，制备定量标准曲线。

1.3统计学方法采用 SPSS17.0 软件进行数据处理，采用 One-way ANOVA 和Independent Samples Test检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1miR-146a定量工作曲线的建立根据通用探针法的原理，将已知浓度的microRNA-146a标准品按miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行Poly(A)修饰反应后，逆转录为cDNA，然后系列稀释，用miR-146a特异的上游、通用下游引物和探针进行扩增，根据扩增Ct值与标准品的原始浓度，建立定量标准曲线(图1A)。系列稀释梯度的cDNA扩增曲线(图1B)所示， miR-146a cDNA扩增按浓度递减呈梯度递减，而水没有扩增。根据扩增结果建立的标准曲线如图1A所示。建立的标准曲线相关系数大于0.99，在浓度范围2 ng~20 μg之间具有较好的线性关系，可以用于后续样品的检测。

2.2病例与对照组人口特征从布病门诊收集布病患者20人，平均年龄48.75岁，男性14人占70%，女性6人占30%，血清抗体滴度1∶50的8人，1∶100滴度6人，1∶200滴度6人；对照组人员20人，平均年龄46.70岁，其中男性13人占到 65%，女性7人占35%。由整理信息发现，布病的患病人群年龄集中在44~54岁之间。临床症状多有发热、关节痛等(表1)。

表1人口特征信息

Tab.1Demographic characteristics

2.3布病组与对照组miR-146a的表达差异从患者和正常人血浆中提取RNA，Poly(A)修饰反应逆转录后进行扩增。布病患者血清中microRNA-146a的平均浓度为0.71 μmol/L(范围0.04~1.58 μmol/L)，而正常健康人的浓度平均为6.75 μmol/L(范围0.18~22.53 μmol/L)。统计分析显示，布病患者血浆中的浓度显著低于正常人(图2，P<0.001)。

2.4miR-146a表达水平与血清抗体滴度的关系依据患者入院血清抗体滴度(Serum antibody titer,SAT)检查资料，按照不同的血清抗体滴度分为1∶50、1∶100和1∶200三组，如图3所示，三组之间差异显著，并且SAT滴度越高，miR-146a含量则越低(P<0.05)。

2.5miR-146a表达与临床特征间的相关性关系按患者入院登记发病至确诊时间，分为<10 d、10~20 d、>20 d三个组，比较3组之间miR-146a的浓度差异，从图4上可以看出，尽管均值之间有差异，但由于组内个体之间表达量差异较大，按时间分的组之间没有统计学差异。将miRNA-146a的浓度与临床症状做相关性分析，发现发热、乏力、关节痛和腰背痛症状的患者与正常人miR-146a的浓度有显著差异(图5A~D)。

3讨论

布氏菌是一种胞内寄生细菌，感染宿主后寄生在宿主体内。为了实现胞内寄生，布氏菌需要通过各种机制抑制宿主的免疫反应，因此，抑制宿主免疫的机制一直是布氏菌致病机制研究的热点。

microRNA作为宿主免疫调节的一种重要机制，已在很多疾病特别是肿瘤等方面，开展了很深入的机制研究，microRNA作为肿瘤诊断的标志物也正在走向临床实践。有关microRNA在布氏菌感染及抑制宿主免疫机制中的作用，目前仍没有相关报道。miR-146a是首个被发现在免疫系统中具有调节作用的miRNA，具有负向调控免疫炎症反应的能力，它的正常表达对防止过度炎症起着重要的作用[8]。相关研究显示，miR-146a在部分恶性肿瘤中表达下调[9]，在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中miR-146a表达也有下调趋势[10]。于是我们预测在布病感染中miR-146a的表达也有变化。本研究选取在宿主免疫调节中发挥重要功能的miR-146a作为研究对象，比较分析了其在布病患者血清中的表达。结果显示，与正常健康人相比，布病患者血清中miR-146a被显著抑制，表明布氏菌通过某种机制或信号途径，抑制了miR-146a的表达。

研究利用布氏菌感染小鼠巨噬细胞并分析microRNA的表达变化，结果显示，let-7b、miR-93、miR-151-3p等miRNAs的表达发生了显著改变，但未发现miR-146a表达有变化，提示miR-146a在布氏菌感染模型与患者的血清中表达有差异[11]。在天然免疫方面，研究发现miR-146a的启动子上有一NF-κB结合位点，通过LPS刺激THP-1(人急性单核细胞白血病细胞)可诱导依赖NF-κB的miR-146a表达上调。经证实，TLR4信号通路中 NF-κB上游的两个关键基因——白细胞介素1受体相关激酶1(IRAK1)及肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是miR-146a的靶基因。miR-146a的表达与IRAK1和TRAF6的表达呈负相关，于是推测miR-146a可能是TLR受体和相关细胞信号通路中的一种新的负反馈调节因子[12]。有研究显示布氏菌内非经典脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是主要的毒力因子之一，而布氏菌的LPS可导致不同的miRNAs反应[13,14]；在获得性免疫方面，miR-146a在活化的T细胞中通过作用其靶基因FADD，发挥抑制T淋巴细胞的活化诱导细胞死亡(Activation induced cell death AICD)的作用，从而抑制IL-2的产生[15]。而在miR-146a基因敲除小鼠模型中，因miR-146a缺失导致调节性T细胞(Treg细胞)部分抑制功能异常，使其丧失对STAT信号通路的抑制作用，IFN-γ表达升高，引起T细胞活化并发生自身免疫性疾病[16]，研究揭示了miR-146a在Treg细胞发挥外周免疫耐受中的重要调节作用。根据本次实验结果分析，布病患者外周血清中miR-146a表达显著下调，说明在布氏菌感染后其表达受到抑制，但其中机制尚不清楚。并且miR-146a的表达量与患者血清抗体滴度相关，SAT值与miR-146a表达量呈负相关。然而通过实验结果发现miR-146a的表达与患者的发病时间并无相关性，而与布病确诊前的临床表现：发热、乏力、关节痛和腰背痛有一定的相关性。这提示miR-146a 在布病的发生及发展过程中并无表达上的改变，其激活以及高表达极有可能与细菌感染程度有关。

综上所述， miR-146a在布病患者血清中表达显著下调，低表达的miR-146a与患者血清抗体滴度检测值大小密切相关，可以协助血清学作出早期诊断。因此，miR-146a表达规律对于理解布病的致病机制并在布病诊断方面具有一定的应用潜力。

参考文献：

[1]Buzgan T,Karahocagil MK,Irmak H,etal.Clinical manifestations and complications in 1028 cases of brucellosis: a retrospective evaluation and review of the literature[J].Int J Infect Dis,2010,14(6):e469-e478.

[2]Minas M,Minas A,Gourgulianis K,etal.Epidemiological and clinical aspects of human brucellosis in Central Greece[J].Jpn J Infect Dis,2007,60(6):362-366.

[3]Fanni F,Shahbaznejad L,Pourakbari B,etal.Clinical manifestations,laboratory findings,and therapeutic regimen in hospitalized children with brucellosis in an Iranian Referral Children Medical Centre[J].J Health Popul Nutr,2013,31(2):218-222.

[4]Sand M,Gambichler T,Sand D,etal.MicroRNAs and the skin: tiny players in the body′s largest organ[J].J Dermatol Sci,2009,53(3):169-175.

[5]Eulalio A,Schulte LN,Vogel J.The mammalian microRNA response to bacterial infections[J].RNA Biol,2012,9(6):742-750.

[6]Taganov KD,Boldin MP,Baltimore D.MicroRNAs and immunity:tiny players in a big field[J].Immunity,2007,26(2):133-137.

[7]Broude NE.Stem-loop oligonucleotides: a robust tool for molecular biology and biotechnology[J].Trends Biotechnol,2002,20(6):249-256.

[8]Sonkoly E,Stahle M,Pivarcsi A.MicroRNAs and immunity: novel players in the regulation of normal immune function and inflammation[J].Semin Cancer Biol,2008,18(2):131-140.

[9]Paik JH,Jang JY,Jeon YK,etal.MicroRNA-146a down regulates NF-κB activity via targeting TRAF6 and functions as a tumor suppressor having strong prognostic implications in NK /T cell lymphoma[J].Clin Cancer Res,2011,17(14):4761-4771.

[10]Tang Y,Luo X,Cui H,etal.MicroRNA-146A contributes to abnormal activation of the type I interferon pathway in human lupus by targeting the key signaling proteins[J].Arthritis Rheum,2009,60(4):1065-1075.

[11]Zheng K,Chen DS,Wu YQ,etal.MicroRNA expression profile in RAW264.7 cells in response to Brucella melitensis infection[J].Int J Biol Sci,2012,8(7):1013-1022.

[12]Taganov KD,Boldin MP,Chang KJ,etal.NF-kappa B dependent induction of microRNA miR-146,an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(33):12481-12486.

[13]Cardoso PG,Macedo GC,Azevedo V,etal.Brucella spp noncanonical LPS: structure,biosynthesis,and interaction with host immune system[J].Microb Cell Fact,2006,5:13.

[14]Lapaque N,Moriyon I,Moreno E,etal.Brucella lipopolysaccharide acts as a virulence factor[J].Curr Opin Microbiol,2005,8(1):60-66.

[15]Curtale G,Citarella F,Carissimi C,etal.An emerging player in the adaptive immune response: microRNA-146a is a modulator of IL-2 expression and activation-induced cell death in T lymphocytes[J].Blood,2010,115(2):265-273.

[16]Lu LF,Boldin MP,Chaudhry A,etal.Function of miR-146a in controlling Treg cell-mediated regulation of Th1 responses[J].Cell,2010,142(6):914-929.

[收稿2015-11-06]

(编辑倪鹏)

Expression pattern of MiR-146a and its correlation with antibody titers in human brucellosis

YUJiu-Xuan,XUXiao-Yang,LEIShuang-Shuang,CHENZe-Liang,WANGJi-Qiu,WANGDa-Li,ZHENGYuan-Qiang,SHIYan-Chun.InnerMongoliaKeyLaboratoryofMolecularBiology,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010058,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression pattern of microRNA-146a in Brucella patients and its correlation with antibody titers.Methods: By using real time PCR assay,expression levels of microRNA-146a in sera samples from 20 brucellosis patients and 20 healthy volunteers were analyzed.The correlation between expression level of microRNA-146a and serum antibody titers were analyzed with SPSS17.0.Results: A quantification curve of microRNA-146a was constructed with synthesized standard.Expression levels of microRNA-146a among brucellosis patients were significantly lower than those in 20 healthy volunteers(P<0.001).For brucellosis patients,the expression level of microRNA-146a was negatively related with antibody titers (P<0.05).Conclusion: Expression of miRNA-146a in brucellosis patients was significantly inhibited and negatively related with antibody titer.

[Key words]microRNA-146a;Brucellosis;Serum antibody titers

通讯作者及指导教师：郑源强(1980年-)，男，博士，副教授，主要从事抗感染免疫研究，E-mail:zhengyq688@163.com。

作者简介：于玖轩(1988年-)，女，硕士，主要从事布鲁氏菌病方面研究，E-mail:yujiuxuan0929@163.com。

中图分类号R392.7

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0230-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.019 10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.020