结核性脑膜炎患者中几种病原诊断检测技术的应用

何红彦， 殷智晔， 李　敬， 张　庆， 邵艳新， 郑立恒



结核性脑膜炎患者中几种病原诊断检测技术的应用

何红彦， 殷智晔， 李敬， 张庆， 邵艳新*， 郑立恒**

摘要:目的 探讨不同病原学检测方法在结核性脑膜炎（结脑）临床诊断中的应用。方法 对临床诊断为结脑患者60例（结脑组）和非结脑患者70例（非结脑组）的脑脊液标本，同时进行离心涂片抗酸染色、结核菌BACTEC MGIT 960快速培养、实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）、玻片离心改良抗酸染色检测，并对其结果进行比较分析。结果 结脑组标本中，涂片抗酸染色、结核菌快速培养、FQ-PCR检测、玻片离心改良抗酸染色法的检出率分别为11.7%（7/60）、6.7%（4/60）、48.3%（29/60）、61.7%（37/60）。非结脑组中2例玻片离心改良抗酸染色阳性。玻片离心改良抗酸染色法检出率高于其他3种检测方法，差异有统计学意义（P＜0.05），且能发现细胞内抗酸杆菌，应用该种方法检测，4例结核菌培养阳性患者的8份脑脊液标本均为阳性。结论 玻片离心改良抗酸染色法操作简便、快速，可明显提高脑脊液中抗酸杆菌的检出率，既能检出细胞外抗酸杆菌，也可检出细胞内抗酸杆菌，此方法可能有助于提高病原检测的阳性率，值得进一步探讨其在结脑早期诊断中的临床意义。

关键词:结核性脑膜炎； 脑脊液； 结核分枝杆菌； 改良抗酸染色

结核性脑膜炎（结脑），是由结核分枝杆菌感染引起的非化脓性炎性反应，除累及脑膜和脊髓膜外，还可侵犯脑实质、脑血管，甚至脊髓，有很高的致残率及病死率，文献报道病死率可达15%～30%，是最常见的致死性肺外结核之一，其预后与早期诊断及时治疗密切相关［1］。从脑脊液中检出结核分枝杆菌是结脑诊断的重要依据。本文对60例结脑患者和70例非结脑患者的脑脊液标本同时进行离心涂片抗酸染色、结核菌快速培养、实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）、玻片离心改良抗酸染色法检测结核分枝杆菌，并对这4种方法的检测结果进行比较分析，为临床工作提供相关数据，以选择恰当、实用的检测方法，满足临床需求。

1　材料与方法

1.1研究对象

2012年 10月—2013年 7月河北省胸科医院收治的结脑患者定为结脑组。2012年 10月—2014 年 1月收治的非结脑患者定为非结脑组。

结脑诊断参照中华医学会编著的《临床诊疗指南结核病分册》标准［2］，根据临床表现、实验室检查、影像学结果及治疗效果等作出临床诊断，且根据结脑诊断专家共识，纳入临床评分大于12分的很可能结脑患者及确诊结脑患者［3］。非结脑的诊断标准参考人民卫生出版社第六版《神经病学》。

1.2方法

1.2.1 标本留取 所有患者入院24～48 h内行腰椎穿刺术，留取脑脊液5～6 mL同时送检传统离心涂片抗酸染色、结核菌快速培养、FQ-PCR、玻片离心改良抗酸染色等检测结核杆菌。

1.2.2 离心涂片抗酸染色检测 留取脑脊液2 mL，加入一次性塑料试管中，3 000 r/min离心15 min，弃去上清液，留取试管底部沉渣吹打后进行涂片，然后按照《结核病诊断实验室检验规程》［4］进行抗酸染色及镜检。

1.2.3 结核菌培养 留取脑脊液1～2 mL进行结核菌快速培养，采用BACTEC MGIT 960 全自动分枝杆菌培养/药敏系统进行结核菌培养及药敏试验，该系统由美国 BD 公司生产。将脑脊液严格按照 MGITTMProcedure Manual 要求进行培养，若满8 周仍无菌生长即报告培养阴性。

1.2.4 FQ-PCR检测 留取脑脊液1 mL进行脑脊液结核分枝杆菌的核酸检测。FQ-PCR检测仪器设备为中山大学达安基因有限公司生产的DA-7600分析仪；试剂盒购于中山大学达安基因诊断中心生产的结核分枝杆菌核酸扩增荧光试剂盒；质控品为试剂盒配套提供。具体操作步骤严格按照试剂盒说明书要求执行。TB-DNA＞50 copy为阳性。

1.2.5 玻片离心改良抗酸染色检测 留取脑脊液0.5～1.0 mL，置于Cytospin-4型细胞玻片离心沉淀仪中，离心速度500 r/min，离心时间5 min。收集细胞制片成功后，用4%多聚甲醛固定玻片15 min，0.3%的TritonX-100浸泡30 min后，按照《结核病诊断实验室检验规程》［4］进行抗酸染色及镜检。

1.2.6 统计学方法 用 SPSS 13.0进行统计学分析，计量资料表示以x±s记录。率的比较用卡方检验，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1一般资料

结脑组60例，男29例，女31例，年龄为16～78岁，平均（36.6 ± 10.3）岁。非结脑组70例，男33例，女37例，年龄14～70岁，平均（34.2 ± 11.6）岁，其中化脓性脑膜炎31例，病毒性脑膜炎30例，隐球菌性脑膜炎6例，脑囊虫病3例。

2.2临床资料

结脑组临床表现主要为发热（54例），头痛（42例），恶心、呕吐（36例）及脑膜刺激征（38例）等。脑脊液常规检测主要表现为压力升高（35例），细胞数轻中度升高（37例），蛋白升高（50例），葡萄糖（53例）及氯化物（54例）低于正常。55例合并颅外结核病灶。60例患者均行头颅核磁共振检查，异常者52例，其中脑膜及基底池明显强化22例，脑内有结核瘤19例，脑积水8例，颅内有梗死病灶3例。从发病到开始接受抗结核治疗的时间为7～40 d，平均（19.5 ± 12.4）d。

2.3结脑组误诊情况

结脑组17例（28.3%）院外被误诊，其中误诊为病毒性脑膜炎8例，化脓性脑膜炎2例，上呼吸道感染2例，脑梗死2例，狼疮脑病1例，血管性头痛1例，颅内肿瘤1例。

2.4脑脊液传统涂片抗酸染色及结核菌快速培养检测

结脑组患者离心涂片抗酸染色阳性7例11.7%），且只能检测到细胞外抗酸杆菌。结核菌培养阳性4例（6.7%），其脑脊液离心涂片抗酸染色均为阳性；非结脑组所有病例均为阴性。

2.5脑脊液FQ-PCR检测

结脑组29例（48.3%）阳性，对照组均为阴性。FQ-PCR与传统涂片抗酸染色及结核菌培养结果相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。4例结核菌培养阳性的患者脑脊液FQ-PCR均为阳性。

2.6脑脊液玻片离心改良抗酸染色检测

结脑组患者改良抗酸染色阳性37例（61.7%），其中有34例（91.9%）发现了细胞内抗酸杆菌；对照组2例阳性。改良抗酸染色法的检出率高于其他3种方法的检出率，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。4例结核菌培养阳性的患者脑脊液玻片离心改良抗酸染色检测均为阳性。

3　讨论

结脑的诊断分为临床诊断和病原学诊断。长期以来，因结脑病原学检测技术的相对滞后，结脑多是通过临床表现、脑脊液常规检测、头颅影像学及是否合并颅外结核等综合分析后作出的临床诊断。但是在临床工作中经常发现，很多结脑患者的临床表现非常不典型，尤其在疾病的初期，缺乏一定的特异性，而脑脊液及头颅影像学等辅助检查也呈现出非特异性表现，很容易误诊，从而延误治疗，有文献报道误诊率可高达50.73%［5］，本组患者中有17例院外被误诊为其他疾病，误诊率为28.3%，因此病原学诊断方法的改进迫在眉睫。

2010年根据结脑诊断专家共识中，提出确诊的结脑在符合临床标准的同时，应具备以下一项或多项，如脑脊液中查到抗酸杆菌，脑脊液结核菌培养阳性，脑脊液结核菌核酸检测阳性；脑或脊髓中发现抗酸杆菌或结核性病理改变［3］。脑组织及脊髓活检在临床工作中难以实现，因此，在结脑的病原学诊断中，目前多采用抗酸染色、结核菌培养和核酸检测等。

涂片抗酸染色法是传统的检测抗酸杆菌的方法，因操作简单，所需设备要求较低且价格低廉，目前在临床上广泛应用，但阳性率较低，文献报道阳性率只有10%左右［6-7］，本组病例中涂片抗酸染色检测抗酸杆菌的检出率为11.7%，与文献报道基本相符。分析其原因主要为：①传统涂片抗酸染色在细胞收集过程中应用试管离心，但由于结核菌密度相对炎性脑脊液来说较低，且经过离心后，使得结核菌极易贴附在管壁上，试管底部获取的结核菌相对较少［8］；②在抗酸染色的过程中，玻片需要反复洗涤染色，结核菌很容易丢失，从而导致阳性率进一步降低；③结核菌属胞内寄生菌，进入机体后迅速被单核吞噬细胞等吞噬，抗酸染色时染料不易进入细胞内，因此造成细胞内结核菌不易被发现；④结核菌细胞壁内因存在大量类脂质，有明显的疏水特性及对外界的抵抗能力，影响染料的渗入［9］；⑤涂片抗酸染色法对标本内的菌量有一定的要求，每毫升标本中需含有104～ 105个抗酸杆菌时才能被检测出，但由于脑脊液存在于蛛网膜下腔内，有着特殊的解剖位置，结核菌量远远小于痰液中的菌量［9］。因此，传统离心涂片抗酸染色的检出率较低，且只能发现细胞外的抗酸杆菌，不能满足诊断的需要。

脑脊液结核菌培养目前采用的是BACTEC MGIT 960 全自动快速培养系统，与传统的罗氏培养法相比，阳性率有所提高，所需时间较短，但费用较高。有文献报道在包括痰液、支气管灌洗液、胸腹水等786份标本的检测中，快速培养与罗氏培养法的阳性率分别为39.2%与34.8%，平均培养时间为11.8 d和20.6 d［10］。但是由于脑脊液中所含的结核菌量较少，且标本离心预处理过程中造成结核菌部分丢失，因此本组患者中脑脊液快速培养法检出率不高，只有6.7%，明显低于其他标本的检出率，且仍需要4～8周的时间才可有培养结果，因此，很难满足早期诊断的需要，但对于培养阳性的标本可进一步行快速药敏试验，其结果在指导后续治疗及耐药性监测等方面具有非常重要的参考价值，临床意义重大［11］。本组患者中有1例培养示耐药结核菌感染，病初抗结核治疗效果一直较差，后根据药敏结果及时调整了治疗方案，预后有了很大的改善。因此，有条件的医疗单位仍需积极送检脑脊液快速结核菌培养及药敏，指导治疗。

近年来，随着分子生物学的不断发展，PCR技术被广泛应用于临床的各种病原体检测。 FQPCR是在常规 PCR 的基础上，加入荧光标记的探针，将光谱技术、核酸扩增、杂交等结合在一起，而且检测是在封闭状态下进行，不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且在一定程度上提高了检测的灵敏度及特异度，并避免了扩增产物污染所致的假阳性［12］。理论上，只要样本中有病原菌存在，FQ-PCR 就可以检测到，因此有很高的灵敏度，而且，操作起来快速省时，仅需 2～3 h即可得出结果。本研究应用该方法检测结核菌的检出率为48.3%，明显高于传统涂片抗酸染色、结核菌培养，差异有统计学意义，但该法需要一定的实验室要求及设备，在基层医院很难推广使用。

鉴于结核菌以上的生物学特性及检测方法的局限性，CHEN等［13］对传统抗酸染色进行了改进，即玻片离心改良抗酸染色法，应用这一方法对29例脑脊液结核菌培养阳性结脑患者的48份脑脊液标本进行检测，阳性检出率达100%，其中93.8%的患者检测出细胞内抗酸杆菌。其优势在于：①改良抗酸染色法在细胞收集环节上，采用玻片离心法，使脑脊液中的有形成分浓集在直径约0.5 cm的范围内，利于寻找抗酸杆菌；②离心速度减慢，离心时间缩短，避免了抗酸杆菌结构的破坏，并保证了免疫细胞的完整性，有利于发现细胞内的抗酸杆菌；③采用多聚赖氨酸挂胶玻片，使细菌及细胞与玻片结合牢固，在抗酸染色反复洗涤操作过程中，不易被洗涤掉；④在进行抗酸染色之前标本经过Triton破膜的预处理，增加了细胞壁及细胞膜的通透性，使得染料更易进入细胞内，细胞内外抗酸杆菌更易着色。因此，通过对传统方法的改进，将涂片抗酸染色的检出率由11.7%提高到61.7%，并能检出细胞内抗酸杆菌。其中传统涂片抗酸染色阳性的7例患者、培养阳性的4例患者及 FQ-PCR阳性的29例患者的脑脊液标本应用该种方法检测均为阳性。对培养阳性的4例患者的8份脑脊液标本应用此法检测也均为阳性。此法快速、简便易行，可作为早期结脑诊断的有效手段，值得临床推广使用［14-15］。

综上所述，传统涂片抗酸染色法及结核菌培养阳性率均不高，不利于结脑的早期诊断。玻片改良抗酸染色法在一定程度上提高了脑脊液中抗酸杆菌的检出率，在检测细胞外抗酸杆菌的同时也可检测出细胞内的抗酸杆菌，其临床操作简单，实验室条件要求相对较低，可推广使用。但此法在临床上仍存在一些不足之处，抗酸杆菌阳性尚不能完全确定为致病性的结核分枝杆菌，仍需进一步研究证实，因此，在有条件的医疗机构，应进行脑脊液结核分枝杆菌基因检测。其次，在非结脑组中有1例隐球菌性脑膜炎患者和1例化脓性脑膜炎患者的改良抗酸染色也为阳性，考虑患者机体免疫功能较差，增加了结核感染的机会，不除外同时合并了结核杆菌的感染。而且，本组脑脊液结核菌培养阳性的病例数较少，在判断新方法的阳性率及特异性上存在局限性，应进一步扩大检测脑脊液结核菌培养阳性的样本数，从而确定玻片离心改良抗酸染色法的准确性。总之，多种方法联合应用，可提高结脑早期病原学诊断率，从而改善预后。

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*临床药学部；**检验科。

中图分类号：R529.3

文献标识码：A

文章编号：1009-7708（2016）03-0336-04

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.015

收稿日期：2015-06-01 修回日期：2015-10-13

基金项目：河北省卫生厅重点课题（20130130，ZD20140425）。

作者单位：河北省胸科医院神经内科，石家庄 050041；

作者简介：何红彦（1980—），女，医学硕士，主治医师，主要从事中枢神经系统感染性疾病诊治研究。

通信作者：郑立恒，E-mail：zhengliheng2006@163.com。

Utility of several methods for etiological diagnosis in patients with tuberculous meningitis

HE Hongyan， YIN Zhiye， LI Jing， ZHANG Qing， SHAO Yanxin， ZHENG Liheng. （Department of Neurology， Chest Hospital of Hebei Province， Shijiazhuang 050041， China）

Abstract:Objective To examine the clinical utility of four methods in diagnosis of tuberculous meningitis. Methods A total of 60 patients with tuberculous meningitis were included as study group and another 70 patients with non-tuberculous intracranial infection as control group. Four methods， including conventional acid fast stain， Myobacterium tuberculous culture in BACTEC MGIT 960， real-time fuorescent quantitative polymerase chain reaction （FQ-PCR） and modifed acid fast stain， were used to assay the cerebrospinal fuid specimens for diagnosis of tuberculous meningitis. Results The positive rate was 11.7% （7/60）， 6.7% （4/60），48.3% （29/60）， and 61.7% （37/60）， respectively in the study group as tested by the four methods. There was signifcant difference between the four methods in the positive rate （P ＜ 0.05）. Modifed acid fast stain was more sensitive than the other 3 methods in identifying tuberculous meningitis （P ＜ 0.05）. This method also could identify the intracellular M. tuberculosis. All the 8 samples from the 4 patients who were positive for culture of M. tuberculosis were positive in the modifed acid fast stain. Conclusions The modifed acid fast staining method is simple， fast， signifcantly more senstive in detection of the acid fast M. tuberculosis in CSF，either extracellular or intracellular. It is worthwhile to further investigate its usefulness in early diagnosis of tuberculosis meningitis. Key words: tuberculosis meningitis； cerebrospinal fuid； Mycobacterium tuberculosis； modifed acid-fast stain