荧光PCR法在手足口病肠道病毒EV71型临床诊断中的意义

2016-01-30柴保山河南省焦作市第三人民医院感染四科河南焦作454000

中国医药指南 2016年17期

柴保山（河南省焦作市第三人民医院感染四科，河南焦作 454000）

柴保山
（河南省焦作市第三人民医院感染四科，河南焦作 454000）

【摘要】目的利用实时荧光PCR检测EV71型肠道病毒，了解焦作地区手足口病流行趋势，并提供防治依据。方法采集2014年4月9日至12月16日焦作地区手足口病患儿肛门拭子407例标本，用实时荧光PCR方法对肠道病毒进行核酸检测。结果检出肠道病毒EV71 型341例，CoXA16型26例型，肠道病毒通用型40例。结论 2014年4月至12月焦作地区手足口病以肠道病毒EV71型为主。实时荧光PCR技术可以对手足口病的治疗及疫情的有效控制提供有力的病原学支持。

【关键词】手足口病；肠道病毒EV71；柯萨奇病毒A组16型；实时荧光PCR

手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）是婴幼儿常见传染病，多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状，少数病情较重者可并发无菌性脑（膜）炎、心肌炎等，个别重症病情进展快，易发生死亡。其主要病原体是肠道病毒，尤其是由EV71引发的［1］，病情凶险，病死率较高。因此，宜采用高效、快速、准确的方法进行检测。荧光PCR技术特异性强、灵敏快速，能有效缩短检测时间，对手足口病的治疗及疫情的有效控制提供有力的病原学支持。现将研究成果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料。①样本采集：2014年4月9日至12月16日手足口病407例。每例采集肛门拭子标本1份并装在3 mL生理盐水采样管中，及时送实验室检测。②仪器设备：美国ABI公司的7500型实时荧光定量PCR仪；江苏默乐生物科技有限公司的EV71、CoXAl6及通用型肠道病毒核酸检测试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取：使用通用型肠道病毒RNA检测试剂盒对所有样本进行RNA检测。检测过程严格按照试剂盒说明书进行操作，首先对样本进行RNA提取后，将所得到的RNA样本进行荧光PCR检测。其判断标准为：EV71病毒Ct值＜35.29并且称典型扩增曲线的为阳性，当Ct值＞38.46时结果为阴性；CA16病毒监测时，Ct值需＜35.86且具有典型扩增曲线的为阳性，其值＞38.64时为阴性；肠道病毒的Ct值＜35.62并且具有典型扩增曲线的即为阳性，Ct值＞38.16时，结果为阴性。当Ct值介于二者之间时，需进行二次复检，如结果仍然在这个区间，则为阳性［2］。

1.2.2 实时荧光PCR反应：EV71、CoXA16及通用型肠道病毒核酸检测试剂盒说明书操作：①PCR反应体系：反应体系总容积为20 µL，内含EV71（CoXAl6）RT-PCR buffer 12.5 µL，Taq酶0.5 µL，RT酶0.5 µL，EV引物探针6.5 µL。②探针检测模式设置为：VIC/HEX荧光选择VIC，将Quencher栏和Passive Reference栏选none。③PCR反应条件：45 ℃15 min逆转录，1个循环；95 ℃变性2 min，1个循环；94 ℃10 s'——58 ℃40 s'，40个循环。④在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，按试剂公司所给的参考值进行结果分析。

2 结果

病毒核酸检测结果：应用荧光PCR的方法，对407例临床样本进行病毒核酸的检测，其结果显示本次监测样本407例中，阳性率为100%。EV71型341例，占83.7%；CoXA16型26例，占6.3%；通用型6例，占9.8%。以肠道病毒EV71型为主，这与国内多个省市手足口病的流行趋势相符。诊断参照卫生部《肠道病毒71型（EV71）感染重症病例临床救治专家共识（2011年版）》，均符合手足口病的症状。