自拟通痹汤对实验性关节炎小鼠的免疫调节作用

★　杨军平　(江西中医药大学附属医院　南昌 330006)



自拟通痹汤对实验性关节炎小鼠的免疫调节作用

★杨军平(江西中医药大学附属医院南昌 330006)

摘要：目的：研究自拟通痹汤对实验性关节炎小鼠单核吞噬细胞系统的吞噬功能、脾细胞抗体生成及迟发性变态反应的影响，探讨自拟通痹汤治疗类风湿关节炎的机理。方法：从吞噬指数K值和吞噬系数α值，脾细胞抗体生成的量，耳肿胀值及胸腺指数探讨自拟通痹汤对类风湿关节炎小鼠免疫调节的变化。结果：自拟通痹汤给药组的吞噬指数K值和吞噬系数α值与模型组比较无显著性差异；自拟通痹汤给药组的脾细胞抗体生成量与模型组相比有显著性差异(P<0.05)；自拟通痹汤高剂量组耳肿胀值与模型组相比有显著性差异(P<0.01)。结论：自拟通痹汤能降低实验性关节炎小鼠脾细胞抗体生成的量,抑制迟发型变态反应，从而调节其免疫功能。

关键词：自拟通痹汤；类风湿性关节炎；免疫功能

类风湿关节炎(RA)是一种以滑膜组织炎性改变为主的自身免疫性疾病，其发病原因可能与遗传、感染及性激素等有关。RA的病理变化是滑膜组织的炎症反应加剧,形成血管翳侵入并破坏软骨，侵蚀软骨下骨组织,最终导致骨关节结构破坏[1-2]。

自拟通痹汤是我院喻建平主任的临床经验方，由通痹风藤、虎杖、羌独活、寒水石等组成。自拟通痹汤具有清热祛风除湿、消肿止痛之功效，适用于类风湿关节炎湿热痹阻证[3]。自拟通痹汤经多年临床应用,疗效显著。本研究从动物实验角度，观察自拟通痹汤对实验性关节炎小鼠的免疫调节的影响，探讨中药治疗类风湿关节炎的机理。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物10个月龄昆明种小鼠(由江西中医药大学动物中心提供)，二级，体重(20±1)g，雌雄各半，明暗为自然光线，室温(24±1)℃、湿度50%±5%，适应环境一周。适应期动物可自由摄食和饮水。动物合格证号为：2012-021。

1.1.2主要仪器电子分析天平(型号：XS105DU,瑞士梅特勒托利多进口电子分析天平厂家)；超级恒温箱(规格型号：501-A，深圳市宝域科技有限公司)；紫外可见分光光度计(型号：7230G,上海天普分析仪器有限公司)；低温离心机(型号：ALLegra X-15R，美国贝克曼库尔特有限公司)。

1.1.3主要试剂和实验药物2，4二硝基氟苯(DNFB)，上海士锋生物科技有限公司，批号950411，分析纯。绵羊红细胞，实验室制备。自拟通痹汤:配制成生药粉,由江西省中医院制剂研究室提供，批号121104。强的松：浙江仙琚制药股份有限公司，批准文号：国药准字H33021207，批号1206018。湿热痹颗粒：辽宁好护士药业(集团)有限责任公司，批准文号：国药准字Z21021523，批号20121201。

1.2方法

1.2.1单核吞噬细胞系统的吞噬功能昆明小鼠60只，体重(20±1)g，雌雄各半，动物称重后按组放置不同的实验间，分笼喂养。采用随机法随机分为六组:模型对照组、西药对照组、中药对照组、自拟通痹汤高剂量给药组、自拟通痹汤中剂量给药组、自拟通痹汤低剂量给药组，每组10只。分组后模型对照组给予等体积的蒸馏水，其余各组按不同剂量灌胃给药，每天1次，连续14d。在末次给药1h后，从尾静脉注射印度墨汁，每只注射0.1mL，分别在注射1min、5min后取血20μL，分别加到2mL的0.1%碳酸钠溶液中,轻轻摇匀，测吸光度值(650nm波长)；小鼠处死后，在冰面上迅速取出肝脏、脾脏，称重。

计算公式：

1.2.2脾细胞抗体生成昆明小鼠60只，体重(20±1)g，雌性，动物称重后按组放置不同的实验间。采用随机法随机分为六组:模型对照组、西药对照组、中药对照组、自拟通痹汤高剂量给药组、自拟通痹汤中剂量给药组、自拟通痹汤低剂量给药组，每组10只。分组后模型对照组给予等体积的蒸馏水，其余各组按不同剂量灌胃给药，每天1次，连续14d。

绵羊红细胞的制备：脱纤维防凝处理的绵羊血，加入适量生理盐水混匀，2000r·min-1离心5min，弃上清，再加入适量的生理盐水混匀，2000r·min-1离5min，弃上清，利用生理盐水分别配制成不同浓度。

补体制备:绵羊红细胞1mL加到5mL的豚鼠血清中，放置4℃环境下,不停振荡30分钟，1500 r·min-1，离心20min,分离的血清保存在-70℃超低温冰箱。使用时血清用PBS缓冲液1∶10进行稀释。给药第10d开始，每组动物腹腔注射2%绵羊红细胞，注射量为0.2mL。给药第14日后，既小鼠免疫4天后,小鼠股动脉取血，处死，匀浆脾脏，细胞浓度调整至2×107mL-1，PBS缓冲液洗。把各1mL的细胞悬液、0.2%绵羊红细胞、补体混合在一起，组成混合液，37℃环境放置1小时。1500r·min-1，离心20min,取上清液，测吸光度值(波长540nm)。

1.2.3小鼠迟发型变态反应昆明小鼠70只，体重(20±1)g，雌雄各半，动物称重后按组放置不同的实验间。采用随机法随机分为七组:正常对照组、模型对照组、西药对照组、中药对照组、自拟通痹汤高剂量给药组、自拟通痹汤中剂量给药组、自拟通痹汤低剂量给药组，每组10只。分组后正常对照组、模型对照组给予等体积的蒸馏水，其余各组按剂量灌胃给药，每天1次，连续14d。

正常对照组外，其余各组小鼠腹部去毛，面积大小约为3cm×3cm，然后将1%二硝基氟苯溶液轻轻地擦拭在去毛范围处，每日涂抹1次,进行致敏。致敏到第5d，将10μL 1%二硝基氟苯溶液均匀擦拭在小鼠左耳朵(正反面),并对小鼠进行攻击。攻击24h后，处死小鼠，分别剪下小鼠的两只耳壳，用打孔器打出耳片,直径约8mm，并称重。同时在冰面上迅速取出小鼠胸腺及脾脏，称重并计算脏器指数=脏器重量/小鼠体重(mg·g-1)；以两耳片重量的差值为耳肿胀值。

2结果

2.1自拟通痹汤对小鼠单核吞噬细胞系统吞噬功能的影响见表1。

表1　自拟通痹汤对小鼠单核

注：与模型对照组相比，*P<0.05。

通痹各剂量给药组吞噬指数K值和吞噬系数α值与模型对照组相比均无显著性差异(P>0.05)，而西药对照组的吞噬指数K值与模型对照组相比有显著性差异(P<0.05)。

2.2自拟通痹汤对小鼠脾细胞抗体生成的影响见表2。

表2　自拟通痹汤对小鼠脾细胞抗体生成的影响±s,n=10)

注：与模型对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

自拟通痹汤给药各组吸光度值与模型组相比有显著性差异(P<0.05)，西药对照组和中药对照组吸光度值与模型对照组相比有显著性差异(P<0.05)。

2.3自拟通痹汤对小鼠迟发型变态反应的影响见表3。

表3　自拟通痹汤对小鼠迟发型变态反应的影响±s,n=10)

注：与正常对照组相比，▲▲P<0.01,与模型对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

模型对照组小鼠耳肿胀值与正常对照组相比有显著性差异(P<0.01)，胸腺指数和脾脏指数与正常对照组相比有显著性差异(P<0.01)；自拟通痹汤高剂量给药组耳肿胀值与模型组相比有显著性差异(P<0.01)，西药对照组和中药对照组耳肿胀值与模型对照组相比有显著性差异(P<0.01)，自拟通痹汤中、低剂量给药组与模型对照组相比无显著性差异(P>0.05)；西药对照组、中药对照组胸腺指数与模型对照组相比有显著性差异(P<0.01)；自拟通痹汤高剂量给药组、西药对照组、中药对照组脾脏指数与模型对照组相比有显著差异(P<0.01)。

3讨论

类风湿关节炎是一种以慢性进行性关节病变为主的自身免疫性疾病，关节受累主要表现为滑膜炎症、渗出、细胞增殖以及肉芽肿形成，当关节累及软骨或骨质时造成软骨及骨组织破坏，导致关节强直及其功能障碍。

类风湿性关节炎发病主要是由细胞免疫系统与体液免疫系统两方面的紊乱所造成的，它涉及到多形核细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、单核-巨噬细胞等，以及细胞因子与炎性介质。我们分别从网状内皮系统的吞噬功能、特异性脾细胞抗体生成和迟发型超敏反应三方面探讨自拟通痹汤对实验性关节炎小鼠免疫调节作用的机理。

网状内皮细胞系统的细胞具有很强的吞噬能力,能吞噬异物、细菌以及衰老与突变的细胞。它包括巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞以及肥大细胞。而吞噬杀伤作用可被补体的免疫粘附作用、特异性免疫中抗体的调理作用及细胞因子所加强。巨噬细胞与T淋巴细胞的表面协同刺激分子受体产生协同刺激信号，诱导T淋巴细胞活化，从而启动免疫应答。在免疫应答的起始反应阶段，巨噬细胞通过处理抗原物质、分泌IL-1、激活淋巴细胞来促进淋巴细胞的分裂与分化；在免疫应答的效应反应阶段，巨噬细胞集聚在病灶周围，在淋巴因子的激活作用下，发挥巨噬细胞的屏障功能[4-5]。从表1可见,自拟通痹汤对小鼠网状内皮系统的吞噬功能无明显影响。

机体的特异性体液免疫应答主要是由B淋巴细胞介导，外来的抗原物质进入机体后诱导B淋巴细胞活化并产生特异性的抗体，发挥重要的体液免疫作用。我们通过检测B淋巴细胞活化产生的特异性抗体的水平来判断B淋巴细胞的功能。将经绵羊红细胞免疫后的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞混合，在补体参与作用下，产生特异性抗体。检测特异性抗体水平的指标是测量脾细胞周围结合了抗体分子的羊红细胞所溶解后形成的溶血空斑。溶血空斑的大小表示脾细胞抗体形成量的多少[4-5]。从表2可知，自拟通痹汤能明显降低绵羊红细胞致敏的脾细胞抗体形成量，明显抑制体液免疫应答。

迟发型超敏反应的发生与吞噬细胞、效应T细胞、细胞毒性介质等密切相关。这是由于效应T细胞作用于相应的抗原后，出现了细胞浸润和组织损伤等炎症反应的重要形态特征[4-5]。从实验结果可以看出,自拟通痹汤对二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应有明显的抑制作用,对特异性细胞免疫有抑制作用。

本研究表明自拟通痹汤只对体液免疫和细胞免疫起作用,对非特异性屏障机能不产生影响，这充分说明该治疗类风湿性关节炎的药物是非常有临床价值的。因此，在临床应用时，自拟通痹汤对治疗类风湿性关节炎既可起到针对性的治疗效果，又可避免因广泛的免疫抑制变化而出现的毒副作用。同时阐明自拟通痹汤对实验性小鼠类风湿性关节炎免疫调节作用，为该药清热除湿、消肿止痛的免疫调节机制提供理论依据。

参考文献

[1]张婷婷,罗静，李小峰.不规则趋化因子简介及其在类风湿关节炎中的作用[J].中国药物与临床，2014(7)：914-917.

[2]Noori S.Immunosuppressive activity of a moLecuLe isoLated from Artemisia annua on DTH responses compared with cycLosporin A[J].ImmunopharmacoL,2004,4(10):1 301-1 306.

[3]杨军平,邱丽瑛,肖亮,等.自拟通痹汤对II型胶原性关节炎关节软骨的作用[J].中国组织工程研究,2012,16(42):7 843-7 848.

[4]张赟,温伟红.细胞和分子免疫学实用实验技术[M].北京：第四军医大学出版社,2013.

[5]何维.医学免疫学[M].北京：人民卫生出版社，2010.

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收稿日期：(2015-07-11)编辑：翟兴英

中图分类号：R285.5

文献标识码：B