RP-HPLC法测定知柏地黄丸中熊果酸含量

★　吴莉　江伟　刘永忠　(.上高县人民医院　江西 上高 336400；.江西中医药大学　南昌 330006)



RP-HPLC法测定知柏地黄丸中熊果酸含量

★吴莉1江伟1刘永忠2(1.上高县人民医院江西 上高 336400；2.江西中医药大学南昌 330006)

摘要：目的：对知柏地黄丸中熊果酸的含量进行快速测定。方法：采用反向高效液相色谱法(RP-HPLC法)测定。结果：熊果酸在0.50μg/mL～10.00μg/mL间具有良好的线性关系(r=0.9985,n=6)，平均加样回收率为100.19%，RSD为0.67%(n=6)。结论：该方法检测结果稳定、准确、重现性好、操作简便。

关键词：RP-HPLC；知柏地黄丸；熊果酸；含量测定

知柏地黄丸来源于清代吴谦主编《医宗金鉴》，由知母、黄柏、熟地黄、山药、山茱萸(制)、牡丹皮、茯苓、泽泻组成，辅料为蜂蜜，有滋阴清热功效，用于潮热盗汗，耳鸣遗精，口干咽燥[1]。组方中山茱萸(制)的主要成分有熊果酸、山茱萸苷、酒石酸、没食子酸等，中国药典2010版采用薄层色谱法对知柏地黄丸进行鉴别(以丹皮酚为对照品)，其含量测定采用高效液相色谱法测定山茱萸(以马钱苷计)和牡丹皮(以丹皮酚计)的含量[2]，实际应用中该法检验周期长，操作繁琐而且误差较大。为了摸索一种更快捷和有效的检测知柏地黄丸质量方法，本文采用反向高效液相色谱法(RP-HPLC法)测定知柏地黄丸中山茱萸有效成分熊果酸的含量。

1仪器与试药

仪器:LC-20A岛津高效液相色谱仪Prominence LC-20A(日本),包括：自动进样器、柱温箱、检测器、四元梯度泵、在线脱气机、柱温箱、G1314B VWD紫外检测器；KQ-250VDB型双频数显超声机(功率:200W,频率:40KHz，昆山市超声仪器有限公司)；色谱工作站(系统控制器Prominence CBM-20A/20ALite)；Sartorius BS124S电子分析天平。甲醇为色谱纯,乙腈(分析纯),水为重蒸馏水(自制)。对照品：熊果酸(中国药品生物制品检定所提供,批号:1107422200314)；知柏地黄丸(浓缩丸)：江西药都樟树制药有限公司提供(国药准字Z36021779,批号：Z20130518)。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱:VenusiLXBP-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-乙腈-0.1%氨水溶液(磷酸调pH～9.0)，其比例为(50∶50∶0.5)；检测波长为210nm；流速为1.0mL/min;柱温为30℃；峰面积外标法定量[3]。

2.2对照品溶液的制备取熊果酸对照品适量，精密称量，置25mL棕色量瓶中，加甲醇-乙腈溶液(4∶1)，制成每1mL含0.1mg熊果酸的溶液,摇匀即得。

2.3供试液的制备取知柏地黄丸适量，仔细研细,精密称定1.0g,置具塞25mL锥形瓶中,加入甲醇-0.1%氨水溶液(20∶1)约20mL,密塞，超声振荡0.5h(功率100w,频率40kHz)，放冷,再加入甲醇-0.1%氨水溶液(20∶1)精密称定重量,摇匀,取续滤液用0.22μm微孔滤膜滤过,即得[3]。

2.4检测波长取适量熊果酸对照品，用流动相(甲醇-乙腈-0.1%氨水溶液，pH～9.0)配成溶液，在150～300nm紫外光区内进行扫描。结果，熊果酸在205nm附近有最大吸收峰，因甲醇在204nm左右有很强的吸收，影响可变波长检测器紫外检测光谱，所以选择210nm为检测波长。

2.5稳定性实验精密吸取供试液20μL进样，分别于0，2，4，6，8，10，12h按色谱条件测定峰面积值，RSD=1.11%，结果显示供试液12h色谱峰面积无明显变化，说明供试液在12h内是稳定的。

2.6系统适应性实验按熊果酸计算理论塔板数10500，熊果酸与相邻峰的分离度大于1.5[4]，拖尾因子在0.95～1.05之间。表明样品中其他成分对熊果酸的测定无干扰。熊果酸的保留时间为18.5min。

2.7标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液0.5，1，2，4，6，8，10mL，分别置于10mL量瓶中，加入甲醇-乙腈(4∶1)稀释，并定容至10mL，即得系列不同浓度的对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液各20μL(n=6)注入色谱仪，记录色谱图。以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，得到熊果酸的回归方程为Y=28.8921X-2.415，r=0.9985，线性范围为0.50～10.00μg/mL，可见线性关系良好。

2.8精密度实验精密吸取3.3中中间浓度的对照液20μL，在上述的色谱条件下，连续重复进样6次，按照色谱条件测定峰面积，计算偏差，得RSD=0.96%。

2.9加样回收率实验精密称取已测含量的知柏地黄丸(浓缩丸)6份，每份约0.5g，加入熊果酸对照品溶液，置具塞25mL锥形瓶中密塞，称定重量，按供试品溶液的制备方法制备。在上述的色谱测定条件下进行测定，测得熊果酸的回收率平均为100.19%，RSD为0.67%。

3样品含量测定

取供试液(n=8)，按照本文色谱条件进行测定，采用外标法进行含量计算，结果见表1。

表1　知柏地黄丸含量测定结果浓度　　(mg·g-1)

4讨论

用甲醇-乙腈(4∶1)进行配制的对照品溶液经过紫外扫描可知，熊果酸在205nm附近有最大吸收峰，因甲醇在204nm左右有很强的吸收，影响可变波长检测器紫外检测光谱，为避开甲醇的干扰，所以选择210nm作为检测波长。

本试验前期做了供试品的制备方法的对比，即超声和回流，分别进行制备30min，结果显示超声操作得到的含量最高；同时对超声时间也进行了比较，分别采用20,30,40,50min超声，结果显示30min提取效果最好，因此本实验采用超声30min方法制备供试品。

山茱萸中同时含有齐墩果酸和熊果酸，但由于多种原因，本次实验未对齐墩果酸进行含量测定，今后实验应同时对山茱萸中齐墩果酸和熊果酸进行含量测定，使得知柏地黄丸质量得到更好控制。

参考文献

[1]程兆盛.现代中成药[M].南昌：江西科技出版社，1997(6)：408.

[2]国家药典委员会.中国药典·一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010：109.

[3]郑琴，郝伟伟，杨明，等.RP-HPLC同时测定止痛方提取物中6种成分的含量[J].药物分析杂志，2011(31):1 269.

[4]刘炜，吴义忠.健胃消食片中熊果酸的含量测定[J].中国现代药物应用，2010,4(1)：5-6.

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收稿日期：(2015-07-07)编辑：翟兴英

中图分类号：R284.1

文献标识码：B