中药饮片鹿血晶PCR检测方法的建立

★　沈海英　鲍方名　顾珉　张国林　黄依雯　李倩　(苏州市食品药品检验所　江苏 苏州 215004)

*第一作者：沈海英(1980—)，女，硕士，主管药师。研究方向：中药材的分子生物学鉴定和药品微生物检验。Tel:13814858420；E-mail:shenhaiyingfey@126.com。



中药饮片鹿血晶PCR检测方法的建立

★沈海英*鲍方名顾珉张国林黄依雯李倩(苏州市食品药品检验所江苏 苏州 215004)

*第一作者：沈海英(1980—)，女，硕士，主管药师。研究方向：中药材的分子生物学鉴定和药品微生物检验。Tel:13814858420；E-mail:shenhaiyingfey@126.com。

摘要：目的：为中药饮片鹿血晶的鉴别，建立PCR检测方法。方法：分别提取鹿血、牛血、猪血、鹿血晶和它们的混合物的基因组，然后加入相应的引物进行PCR扩增和产物检测。结果：用鹿、牛和猪的全血提取基因组后进行PCR扩增，扩增后它们各自PCR产物的大小分别为鹿408bp,牛271bp和猪149bp；用鹿特异性引物，扩增不同动物血液来源基因组，结果显示该引物对鹿血具有特异性。选取市场上两个生产厂家的鹿血晶，经PCR检测，均检出鹿特异性目的条带。结论：用PCR的方法鉴别中药饮片鹿血晶的真伪，是一种客观可靠的方法。

关键词：中药饮片；鹿血晶；PCR；鉴别

目前市场上含有鹿血的保健品有十几个品种，但是由于鹿血来源稀少及其珍贵的药用价值，所以市场上鹿血成分鱼目混珠，常用比较廉价的猪血、羊血、牛血等动物血以假乱真。传统的方法无法区分动物血的来源。DNA核酸序列和特异引物PCR扩增在动物药材鹿茸、鹿鞭、乌梢蛇、龟板、土鳖虫、蜈蚣等鉴定方面都取得了良好效果[1]，但其在鹿血来源的应用还无相关报道。因此本研究为了鉴别中药饮片鹿血晶的真伪，建立PCR检测方法。

1材料和方法

1.1试剂DNA提取试剂盒(天根：TIANamp Genomic DNA Kit,吸附柱批号：M1104)；DREAM Taq Green Pcr Master Mix(2×)12.5μL(Thermo Scientific，批号:00108596)；引物序列见表1，由上海生工合成。

表1　鹿、牛、猪PCR检测引物信息表

1.2药材梅花鹿血、牛血、猪血(由苏州市红冠庄国药饮片有限公司提供)；鹿血晶1购于苏州市红冠庄国药饮片有限公司(批号：1211022)；鹿血晶2购于合肥乐家老铺中药饮片有限公司(批号：12040102)。

1.3实验仪器高速低温离心机：Thermo scientific Biofuge primo R；凝胶成像系统：GEL DocTM XR+ Bio RAD；电泳仪：Bio-RAD Power Pac TM Basic；PCR仪：AB AppLied Biosystems。

1.4方法

1.4.1模板DNA提取按试剂盒使用说明提取鹿血(鹿全血约50μL)、牛血(牛全血约50μL)、猪血(猪全血约50μL)和鹿血晶(约15mg)的基因组DNA。

1.4.2PCR反应体系在200 μL离心管中进行，反应总体积为25 μL,DREAM Taq Green Pcr Master Mix (2×) 12.5 μL(Thermo Scientific，批号：00108596)，20μM的引物各0.75 μL，DNA模板1.25 μL，去离子水9.75 μL。阴性对照为灭菌去离子水。阴性对照试验除反应中不加模板DNA外，均按上述测定条件和步骤进行。

1.4.3PCR反应循环参数见表2。

1.4.4电泳检测称取适量的琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，配置成质量浓度为1.5%的溶液，加热溶解，稍加冷却后，加入GeLRed溶液至终浓度为0.1μg/mL。制胶时将凝胶倒入盛有1×TAE缓冲液的电泳槽中，垂直向上拔去梳版。吸取5～8μLPCR扩增产物点样。其中一个泳道中加入DNA分子量标准品3～6μL作用(按试剂说明确定加样量)，接通电源电泳，按5V/cm的电压电泳30～60min。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。

表2　3种动物基因PCR反应参数

1.4.5结果判断凝胶电泳图谱中，待测鹿血晶在与梅花鹿血液对照品凝胶电泳图谱相应的位置上(408bp)，有单一DNA条带为正品。

2结果

2.1采用文献报道的鹿、牛和猪特异性基因片段引物，用鹿、牛和猪的全血提取基因组后进行PCR扩增，扩增后电泳结果见图1。它们各自PCR产物的大小分别为鹿408bp,牛271bp和猪149bp。

1.鹿血；2.牛血；3.猪血；4.阴性对照；5.DNA marker

2.2用鹿特异性引物，扩增不同动物血液来源基因组结果见图2。可见该引物对鹿血具有特异性。其不能扩增出牛和猪血的特异性条带，而对鹿血和鹿血与其它动物血的混合物(两者1∶1混合)，能扩增出特异性条带。

1.鹿血；2.牛血；3.猪血；4.牛血+鹿血；

1.鹿血；2.鹿血晶1；3.鹿血晶2；4.阴性对照；5.DNA marker

1.DNA marker；2.鹿血晶量：29.75mg;3.鹿血晶量:15.25mg;

2.3不同来源鹿血晶PCR扩增结果见图3。选取市场上两个生产厂家的鹿血晶，经PCR检测，均检出鹿特异性目的条带。

2.4不同含量鹿血晶PCR扩增结果见图4。称取不同量的鹿血晶，进行基因组DNA提取，提取后进行PCR扩增，发现当鹿血晶的含量为1.51mg时(为常规用量十分之一左右)仍能扩增出目的条带。

3讨论

中药饮片鹿血晶为纯梅花鹿或马鹿血制成，其性热、味甘咸，具有养血益精，行血祛瘀、消肿疗伤等作用[4]。现代研究表明，鹿血制品含有丰富的造血干细胞和多种造血因子，包括G-CSF、GM-CSR、M-CSF等。目前市场上鹿血成分鱼目混珠。有关鹿血的鉴别，虽然有免疫学抗原抗体沉淀法、聚丙酰胺凝胶电泳等方法报道，但由于方法繁琐等原因，这些方法未能得到广泛应用[5]。

本研究选用的引物，针对《中华人民共和国药典》规定其正品为鹿科动物梅花鹿或马鹿的线粒体基因设计，对鹿血基因组DNA进行PCR扩增，可以得到预期大小的目的片段；两批市售鹿血晶饮片检出和鹿血大小一致的目的片段；对牛血、猪血基因组DNA进行PCR扩增，未得到预期大小的目的片段；对不同含量鹿血晶PCR扩增结果发现当鹿血晶的含量为1.51mg时(约为常规用量15mg左右的十分之一)仍能扩增出目的条带。故对样品DNA提取液进行鹿内源基因的PCR扩增，以鹿基因组DNA作为阳性对照，如阴性对照未出现扩增条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带，则可初步判断待测样品含有鹿源性成分。如待测样品未出现PCR扩增产物，则可判断待测样品不含鹿源性成分(或极其微量)。

本方法的局限性：1)只能检测出是否含有鹿血成分，无法对其含量进行测定。2)根据文献报道，本研究选用的鹿引物是针对梅花鹿和马鹿，而对其他品系鹿血的样品是否可以分辨，由于取材困难，本文未做相应的探讨。3)本研究只探讨了鹿血晶常见伪品血来源猪血和牛血对该方法检测不具有干扰，而该方法对其他鹿血晶伪品血是否能有效检出，有待于进一步研究。

参考文献

[1]白根本，张林源，刘春生，等.鹿源类中药材DNA序列分析及马鹿和梅花鹿的PCR鉴定[J].中草药，2006，37(10)：1 566-1 569.

[2]刘向华，王义权，周开亚，等.鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究[J].药学学报，2001，36(8)：631-635.

[3]武艳军，刘思国，陈建泉，等.PCR方法鉴别动物血球蛋白粉的来源[J].饲料工业，2009，30(7):33-35.

[4]孙红，李占东，薛冬，等.中药鹿血晶治疗化疗后血小板减少症的临床观察[J].中国医院用药评价与分析，2012，12(9)：832-833.

[5]郭月秋，陈代贤，刘辉，等.聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别鹿血与其它动物血[J].时珍国医国药，2000，11(3)：232.

收稿日期：(2015-06-10)编辑：翟兴英

中图分类号：R286

文献标识码：B