厚朴复方制剂对抗生素相关性腹泻大鼠的治疗作用

李建军，李建国，温　超，王　震

厚朴复方制剂对抗生素相关性腹泻大鼠的治疗作用

李建军1,2，李建国2，温超1，王震3*

[摘要]目的观察厚朴复方制剂治疗抗生素相关性腹泻(Antibiotic-associated diarrhea，AAD)的作用。方法采用庆大霉素和头孢拉定联合灌胃制备抗生素相关性肠炎模型，将30只大鼠随机分为正常组、模型组、厚朴复方制剂组。厚朴复方制剂组灌胃给药每日2次，每次1.5 mL，共14 d；正常组和模型组给予同体积的生理盐水。观察各组大鼠给药前后肠道菌群变化、血清二胺氧化酶(Diamine oxidase，DAO)和D-乳酸含量以及肠粘膜分泌型免疫球蛋白(Secreted immunoglobulin,SIgA)水平。结果与模型组相比，厚朴复方制剂组治疗14 d时，肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的数量均显著增多(P<0.01)；血清DAO和D-乳酸的含量均显著降低(P<0.01)；肠粘膜SIgA水平均显著升高(P<0.01)。结论长期应用抗菌药物能引起菌群失调和肠粘膜屏障损害。厚朴复方制剂治疗AAD，能够调节肠道菌群、修复损伤的AAD大鼠的肠粘膜屏障，包括菌群屏障、机械屏障和免疫屏障。

[关键词]厚朴；抗生素相关性腹泻；二胺氧化酶；D-乳酸；SIgA

[Abstract]ObjectiveTo observe the therapeutical effect of traditional Chinese medicine prescription containing Magolia of ficinalis on antibiotic-associated diarrhea in rats.MethodsTotal of 30 male rats were randomly divided into three groups:normal group (N group),antibiotic-associated diarrhea group (AAD group),treatment group (AAD+H group).Rats in AAD+H group were intragastrically administered with traditional Chinese medicine prescription containing Magolia of ficinalis,and the other two groups were intragastrically administered with normal saline lavage.After making the models of cidomycin and cefradine induced antibiotic-associated diarrhea,the variety of bacteria in intestinal tract was determined;the content of diamine oxidase and D-lactic in serum were measured;the level of secreted immunoglobulin in intestinal mucous membrane was observed.ResultsCompared with AAD group,Enteric bacilli,Bacillus bifidus and Bacillus acidi lactic in AAD+H group significantly increased,the content of diamine oxidase and D-lactic in serum significantly decreased,the level of secreted immunoglobulin in intestinal mucous membrane significantly increased(P<0.01)at 14 d after treatment.ConclusionLong period application of antibiotics could induce disorder of microbial floras and injury of intestinal barrier,increase intestinal injury.The praeparatum (containing Magolia of ficinalis)could improve the disorder of intestinal floras and strengthen intestinal mucous membrane barrier including ecological barrier,mechanical barrier and immunologic barrier in AAD rats.

收稿日期：2015-05-09

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512006

Therapeutical effect of traditional Chinese medicine prescription containingMagoliaofficinalison antibiotic-associated diarrhea in ratsLI Jian-jun1,2,LI Jian-guo2,WEN Chao1,WANG Zhen3*(1.Graduate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.Brain Hospital Affiliated Hospital of The Armed Police Logistics College,Tianjin 300162,China;3.Department of Medical Science,Affiliated Hospital of The Armed Police Logistics College,Tianjin 300162,China)

Key words：Magoliaofficinalis;Antibiotic-associated diarrhea;Diamine oxidase;D-lactic;Secreted immunoglobulin

0引言

临床长期使用抗菌药物可导致抗生素相关性腹泻(Antibiotic-associated diarrhea,AAD)，后者不仅加重了危重患者的病情，甚至增加患者的死亡率，给家庭及社会带来沉重的负担。有文献报道，对于AAD患者，每天要多花费将近1 h进行额外的调查、治疗和护理[1]。抗菌药物的广泛使用使AAD患病率呈上升趋势。普遍认为，AAD没有特效疗法，依据以菌治菌的原理，微生态调节剂益生菌对抗菌药物引起的肠道菌群失调有预防作用，对AAD患者肠道微生态平衡有调节作用，但其在抗菌药物使用患者中应用的安全性尚不确定。祖国医学认为，腹胀是胃肠气机不畅所致。厚朴具有理气消胀、泻热通腑之功效，可促进胃排空及小肠推进，对中毒性肠麻痹有很好的疗效。厚朴制剂能否改善AAD大鼠肠粘膜各种屏障功能成为医学研究的热点。本文观察厚朴复方制剂在治疗抗生素相关性腹泻过程中肠道菌群、血清二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)和D-乳酸含量以及肠粘膜分泌型免疫球蛋白(Secreted immunoglobulin,SIgA)水平的变化，以期对AAD的临床治疗提供参考。

1材料与方法

1.1实验动物与分组SD大鼠(SPF级)，购自天津医科大学实验动物中心，30只，雄性，体重180~220 g，在室温20~22 ℃、相对湿度45%~50%的动物房中饲养，光照周期10~12 h。

1.2主要试剂硫酸庆大霉素注射液(2 mL∶8 万UA/支，山东鲁抗辰欣药业有限公司)；头孢拉定胶囊(0.25 g/粒，石药集团欧意药业有限公司)；SIgA试剂盒(中国原子能科学研究院同位素研究所)。

1.3模型制备与给药将30只大鼠随机取出10只作为正常组，其余20只每只每日灌胃给药量分别为硫酸庆大霉素210 mg和头孢拉定240 mg，按用药量配成浓度为75 g/L混合溶液(即14支庆大霉素与6粒头孢拉定胶囊)，4 ℃冰箱中保存备用，每只每次给药3 mL,每日灌胃2次(每次灌胃前禁食2 h)，连续给药7 d，造成AAD大鼠模型[2]。连续给硫酸庆大霉素和头孢拉定7 d时，观察大鼠出现精神萎靡,体重下降,毛色无光,肛周微红,并出现不同程度的腹泻，大便呈粒状，但“稀湿”，水分含量相对增多，颜色加深，呈黑色，能轻易捏碎，碎后易粘手，说明造模成功。将20只造模成功的大鼠随机分为模型组和厚朴复方制剂组。厚朴复方制剂灌胃给药每日2次，共14 d；正常组和模型组给予同体积的生理盐水。厚朴复方制剂：厚朴9 g，白术18 g，熟地30 g，干姜9 g，山萸肉30 g，龙骨18 g，牡蛎18 g，共150 g，各药物加2倍水浸泡，30 min后将龙骨、牡蛎大火煎煮至沸后转中火，20 min后加入其他药物再煎煮15 min，过滤，再加适量水，煎煮15 min，过滤，合并两次滤液，65 ℃恒温水浴浓缩至2 g/mL，置4 ℃冰箱保存备用，每只鼠每次1.5 mL，2次/d。

1.4观察指标及测定方法

1.4.1肠道菌群检测处死大鼠后，无菌操作从盲肠中取出内容物，加生理盐水稀释，震碎摇匀，按常规培养方法进行细菌培养。以菌落形态，生化反应以及革兰染色鉴定肠杆菌、双歧杆菌和乳杆菌。培养好的细菌经鉴定后，计算每毫升盲肠内容物中细菌的数量。

1.4.2二胺氧化酶和D-乳酸含量测定连续给予14 d后，以颈椎脱臼法处死大鼠，心脏取血5 mL，检测血清二胺氧化酶和D-乳酸的含量。

1.4.3肠粘膜SIgA检测肠腔粘液采集：取自幽门下10 cm处开始往回盲部方向15 cm肠段，平铺滤纸上，沿纵切面剖开，用无菌PBS缓冲液冲洗干净肠粘膜表面物质，最后用载玻片在肠粘膜表面，轻轻刮取部分粘液，放入1.5 mL无菌EP管冻存待测。按试剂盒说明书，采用生物素-抗生物素标记的酶联免疫检测法分析肠粘膜中SIgA水平。

1.5统计学分析所有数据采用SPSS 17.0 软件包进行处理，数据均采用±s表示，组间比较采用双因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1肠道菌群的比较大量使用庆大霉素和头孢拉定7 d，可导致肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌减少，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01)；而使用厚朴制剂治疗后，肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌逐渐增多，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1　大鼠肠道菌群数量的比较(logCFU/g)

注：**与正常组比较，P<0.01；##与模型组比较，P<0.01

2.2血清DAO和D-乳酸含量测定模型组血清DAO和D-乳酸的含量均明显高于正常组(P<0.01)，经药物治疗后，血清DAO和D-乳酸的含量较模型组显著降低(P<0.01)，见表2。

表2　大鼠血清DAO、D-乳酸及肠粘膜SIgA含量比较

注：**与正常组比较，P<0.01；##与模型组比较，P<0.01

2.3肠粘液SIgA含量测定长期使用庆大霉素和头孢拉定的大鼠，可导致肠粘膜SIgA水平降低(P<0.01)，而使用中药治疗后，肠粘膜SIgA水平均较模型组显著升高(P<0.01)，见表2。

3讨论

正常人体肠道内寄居着数量庞大、种类繁多的微生物，以细菌为主，统称为肠道菌群，其细胞总数高达1014、种类>1 000种，是人体细胞总和的10倍[3]。肠道正常菌群对宿主有消化、吸收、营养、生物拮抗等生理作用，参与人体的生理、生化、病理和药理过程，与人体形成了相互依存、相互受益、相互协调又相互制约的动态平衡统一体，实际上已成为宿主生命必需的组成部分[4]。AAD是由于抗菌药物的使用造成肠道菌群紊乱，改变肠粘膜分泌、吸收功能，加快肠蠕动，从而引起以呕吐、腹泻等临床症状为主要表现的消化系统疾病，其发病的机制尚不明确，但与肠道菌群种类及数量上的失调有很大关系。Ladirat等[5]研究发现，抗菌药物所致肠道菌群失调的水平与用药剂量相关，高剂量组菌群变化更明显。肠道菌群变化的同时也影响机体摄入食物的消化吸收、肠道粘膜分泌免疫等功能。肠粘膜具有三类屏障功能，即肠道中正常存在的菌群所形成的菌膜屏障，肠粘膜完整的结构所组成的物理机械屏障以及肠壁内的免疫细胞、肠腔内的免疫球蛋白形成的免疫屏障。免疫屏障包括多种免疫成分，以SIgA为主的体液免疫起主导作用。肠道致病菌多为革兰阴性杆菌，SIgA与革兰阴性杆菌有很强的亲和能力。SIgA结合革兰阴性杆菌后，可阻碍该菌在肠道粘膜表面的粘附和定植，从而减少后者的数量。SIgA能与毒素结合，起到中和毒素的作用；另外，可以与补体以及溶菌酶协同对肠道致病菌有直接杀菌作用。因此，SIgA是防御致病菌在肠粘膜粘附定植的第一道防线，在阻止肠源性感染中具有重要作用。

二胺氧化酶(DAO)是广泛存在于哺乳动物和人类肠粘膜的上皮绒毛细胞内，具有催化二胺活性的氧化酶，其活性与肠粘膜上皮绒毛的高度以及肠粘膜细胞内核酸、蛋白质的生化合成有密切关系。当肠道粘膜受损，粘膜上皮细胞破坏时，DAO将流入肠腔，被暴露出的肠粘膜细胞间隙内血管和淋巴管所吸收，导致血液中的二胺氧化酶含量以及活性都随之升高[6-7]。因此，测定肠黏膜受损时血浆中的DAO含量，可以反映出肠黏膜受损情况[8]。肠道菌群紊乱时，条件致病菌也会进入肠腔肠粘膜上皮间隙，导致肠道粘膜屏障的进一步损伤以及菌群移位[9]。D-乳酸是肠道细菌独有的代谢终末产物，哺乳动物和人类既不能生产，也不能代谢或仅缓慢代谢D-乳酸。肠粘膜正常时，血清中检测不到D-乳酸，只有在肠道粘膜受损，上皮细胞破坏脱落时，肠腔内的D-乳酸才会通过创面进入血流，在血液中检测到。DAO的变化同时也会受到肠外因素和肠微生态环境的影响[10]。本实验结果表明，AAD组大鼠血清DAO和D-乳酸含量明显升高，说明抗菌药物作用7 d后，大鼠肠粘膜屏障的完整性遭到破坏，肠屏障功能受损。

目前，对AAD中医的辨证主要分型为脾肾阳虚、脾虚湿阻、湿热内蕴三证，在准确辨证的基础上，针对素体虚弱的病本采用健脾益气之法，再根据兼证之不同以治其标[11]，结合中医理论维持机体状态的平衡是关键。近年来，已经有一些中药制剂应用于AAD治疗的研究，如参苓白术散、肠宁汤、七味白术散[12-14]，效果显著。厚朴 (Magnolia of ficinalis Rehd,et wils) 为木兰科植物厚朴的干燥干皮、枝皮或根皮，是我国传统芳香化湿中药。厚朴味苦，具有温中、化湿、行气的功能，主治气滞、食积、便秘。厚朴乙醇提取液具有很好的抑菌强度和抑菌范围，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假丝酵母菌、芽孢杆菌等微生物均具有较好的抑制效果[15]。

本研究对厚朴复方制剂治疗庆大霉素和头孢拉定导致的抗生素相关性腹泻大鼠肠道粘膜的菌膜屏障、机械屏障和免疫屏障进行了全面研究，结果表明，厚朴复方制剂对AAD大鼠肠粘膜的三种屏障均具有保护和修复作用，这为临床提供了一个新的治疗AAD的研究方向。

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作者单位：扬州市第一人民医院病理科，江苏 扬州 255000