兔骨髓细胞与PLGA/HA多孔支架和人同种骨植入材料（异体骨）相容性的对比研究

李忠义 冀 希（沈阳医学院附属中心医院手外科，辽宁 沈阳 110024）



兔骨髓细胞与PLGA/HA多孔支架和人同种骨植入材料（异体骨）相容性的对比研究

李忠义 冀 希
（沈阳医学院附属中心医院手外科，辽宁 沈阳 110024）

【摘要】目的 探讨新型多孔聚乳酸乙醇酸（polylac-ficglycolic acid，PLGA）/羟基磷灰石（hydroxyap-atite，HA）的复合支架材料（即PLGA/HA）相容性。方法 兔骨髓基质细胞（即BMSCs）用贴壁法行体外矿化诱导培养、扩增后，分别与实验A组（含10%HA的PLGA/HA和实验B组（即异体骨）行体外复合培养，定性和定量法检测材料表面BMSCs的黏附能力和增殖活力以证实复合体成骨活性，并对检测结果进行比较。结果 两组均可见兔BMSCs生长，并在支架材料表面形成钙结节，两组细胞黏附和增殖能力无明显差异。结论 兔BMSCs与PLGA/HA支架材料和的异体骨具有相似的体外相容性，PLGA/HA可以作为异体骨替代材料。

【关键词】兔骨髓基质细胞；聚乳酸乙醇酸/羟基磷灰石支架；异体骨；组织工程

骨缺损畸形修复作为整形、颌面外科等学科研究的重点，随着支架材料的创新，其治疗思路发生了重要转变。本文通过对比PLGA/HA与异体骨支架的相容性，旨在为临床支架材料的发展提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料：大白兔3只，月龄3个月，体质量2.5～3.0 kg，PLGA/HA（沈阳工业大学材料系制作），异体骨（异种异体骨），低糖DMEM培养基（海克隆），胎牛血清（新西兰进口），胰蛋白酶，四环素盐酸盐（Sigma），碱性磷酸酶（AKP）测试盒+4（南京建成），层流超净台，三洋（SANYO）CO2培养箱，Nikon TE2000-S倒置显微镜，中佳（Zokia）低速离心机，25 cm2及75 cm2培养瓶，六孔培养皿。

1.2 方法

1.2.1 分离培养兔BMSCs：局部麻醉起效后，无菌条件下在兔股骨大转子部位抽取2 mL骨髓，无菌管收集后添加肝素，离心（1500 r/min）10min，去除上清液，添加标准培养液，吹散细胞团置于培养瓶中在37 ℃、5% CO2环境中培养，隔日换液1次。待约80%细胞发生融合后，去净培养液，添加0.25%胰酶消化2 min，待细胞团缩后，添加培养液，吹打未脱落细胞置入离心管，吹打分散均匀，计数细胞数量。细胞悬液再次离心，弃上清液，添加标准培养液，均匀接种在培养皿内培养，3 d换液1次，待80%细胞融合时再次传代。

1.2.2 制备支架材料：PLGA/HA材料和异体骨材料分别用诱导培养液浸泡，预湿24 h后，用滤纸吸干材料内液体，备用。

1.2.3 接种细胞：取第3代兔BMSCs，经消化后调整细胞浓度至1× 106/mL，将细胞悬液分别接种在支架材料和异体骨上至饱和。培养板放在培养箱内孵育4 h，再次接种细胞达1×105/mL，添加诱导培养液将材料浸泡后在培养箱内培养，隔日换液。

1.3 检测指标：应用倒置相差显微镜观察细胞形态和生长情况。计数细胞，测定细胞黏附率和增殖情况，用酶联免疫法定量检测碱性磷酸酶（alka line phosphatase，ALP）活性。用荧光显微镜下利用四环素荧光染色法观察钙结节形成情况。

1.4 统计学处理：采用SAS6.1版本软件分析数据，定量资料用t检验分析，P＜0.05，差异具有显著性。

2 结 果

兔BMSCc原代细胞培养5d后开始贴壁生长并形成克隆，而且经过复合培养后，材料表面均可见绿色荧光，提示钙结节形成。PLGA/HA组细胞黏附率为34%，异体骨组细胞黏附率为32%，接种后第3天和第7天时PLGA/HA组和异体骨组细胞计数相仿，接种培养第7天，PLGA/HA组ALP活性为（4.31±0.26），异体骨组ALP活性为（4.41± 0.23），第14天时，PLGA/HA组ALP活性为（7.01±0.51），异体骨组ALP活性为（7.25±0.53），经统计学分析上述各项指标两组间均无明显差异（P＞0.05）。

3 讨 论

随着组织材料的发展，骨缺损修复效果得到了明显提高，支架材料作为骨组织工程重点研究课题，一直受到临床的广泛关注，尤其是复合材料研究更是备受关注［1］。PLGA和HA作为最常用的复合物，其中PLGA属于有机高分子材料，具有较好的生物相容性，但是由于亲水性较差，而且缺乏骨诱导性，因此黏附能力、机械强度以及功能修复存在一定的缺陷。HA作为骨组织重要的无机成分，细胞亲和度较好、抗压强度较高，相关研究认为将PLGA和HA复合后不仅能够降低降解速度，而且能够提高材料强度、中和部分酸性产物。虽然关于PLA/HA组织支架制作的研究较多［2-3］，但是目前临床极少涉及应用PLGA/HA支架材料进行骨组织修复。本实验结果显示，兔BMSCs于PLGA/HA支架材料和异体骨分别进行体外复合培养后，两种支架材料均能够在组织表面存活、增殖，而且二者间的细胞黏附率、钙结节形成情况、细胞增殖情况以及ALP活性均无明显差异，表明PLGA/HA材料与骨细胞的结合能力与异体骨相似，而且其生物相容性与异体骨不存在明显差异，因此我们认为PLGA/HA可以替代异体骨进行骨修复，进行PLGA/HA支架修复骨缺损动物在体实验研究具有科学依据。

参考文献

［1］ 王红忠，姚志文，杨安.多孔细菌纤维素/聚乳酸-羟基乙酸聚合物/羟基磷灰石复合纤维支架生物相容性研究［J］.中国当代医药，2013，19（19）:4-5.

［2］ 姚志文，李红玖，刘唯，等.多孔细菌纤维素-聚乳酸乙醇酸复合支架制备及性能研究［J］.现代医院，2012，12（6）:12-14.

［3］ 张世杰，裴国献，潘可风，等.新型多孔PLGA/HA复合支架体外细胞相容性的实验研究［J］.中国美容整形外科杂志，2007，18（2）: 98-101.

中图分类号：R687

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）12-0033-01

基金项目：沈阳医学院科技基金项目：20142042