口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测方法的操作注意事项

胡珊莲

(上海市闸北区江场西路上海光明荷斯坦牧业有限公司，上海闸北 200436)



兽医防疫

口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测方法的操作注意事项

胡珊莲

(上海市闸北区江场西路上海光明荷斯坦牧业有限公司，上海闸北 200436)

液相阻断ELISA用于检测家畜血清中的口蹄疫(FMD)抗体，具有灵敏性高、特异性强、稳定性好等特点。但因耗时较长，操作步骤繁多，操作中稍有不慎就会导致实验结果发生偏差或试验失败，因此必须谨慎操作。

1样品或试剂的保存和使用

全血样品采集后应尽快分离血清避免溶血，3500～4000 rpm离心5～10 min，血清0～4℃条件下可保存5 d，如采用-15～-20℃冷冻保存则更好。冷冻保存血清样品需在4～8℃条件下解冻，再平衡至室温，稀释前需充分混匀。

口蹄疫O型病毒抗原-20℃保存，其余试剂盒组分置于2～8℃保存。检测前，试剂盒内的所有试剂、包被反应板放置1～2 h平衡至室温(20～25℃)，冬季可置于25～37℃左右的恒温培养箱内。为使实验结果准确，应避免使用不同批次的试剂盒及试剂成分。

2试剂配制

配制试剂前后都要充分混匀，浓缩的PBST液，低温下会有无机盐结晶析出，使用前可水浴或恒温培养箱融化，用无离子水或超纯水25倍稀释，用NaOH或稀HCl溶液调整至pH 7.4。

底物溶液按操作说明配制，现配现用。OPD有致癌性，配制时一定要注意不能接触皮肤。配制时避光溶化，为无色透明液体，4℃避光保存，如有变色，则不能使用。用时按需要量倒出,临用前每1 mL加10 μL本试剂盒配备的3%双氧水，否则酶标板将无法显色，导致实验失败。

3稀释

稀释过程中, 要注意使用同一微量加样器、枪头和稀释板,保证所稀释液体容量一致。

稀释过程中，操作人员应注意每稀释一个样品调换一次枪头，不能连续使用。

4加样

加样应避免在冷气、光照、热源或通风口等温度不均匀位置进行，注意不能将反应板直接放在冰冷的实验桌面上，可垫上垫布作为缓冲。

加样不宜太快,不可溅出和产生气泡，每次加样都要保持同样的加样顺序，板数多者要单独计时，保证每板反应时间充足。

5孵育

孵育前要封好膜，盖严，避免水分蒸发。

孵育时不可重叠放置，避免受热不均，且要避免人为缩短或延长孵育时间。

6洗涤

洗涤是ELISA操作中关键技术之一, 300 μL 3～5次洗板，每次浸泡时间一般为30 s。

洗板时需保证酶标板平放，将洗涤液注满各孔，避免漏液、溢液现象。

7拍板

每次拍板时都要更换吸水纸，同时避免手指接触板底。拍板时应注意观察板孔内有无气泡附着，如有气泡加样前应一一去除。

8显色

显色是ELISA 操作中的最后一个反应步骤,这时酶催化无色底物, 生成有色产物。反应温度和时间是影响显色的因素。加入底物后的反应温度应严格按实验操作说明书执行。根据底物显色情况，反应时间可适当调整为10～15 min。

9OD值读数

加入终止液终止反应后应立即在492 nm波长下读取吸光值，读数前，保证酶标板底板清洁无污染，如有水分应仔细擦干，提前15 min打开酶标仪，使之稳定并用空气调零。

为使实验获得正确结果，操作人员应在实验前仔细阅读实验说明书，试验时要严格按试验步骤操作, 对每个环节进行优化, 提高试验结果的精确性,保证试验结果的真实性和客观性。

收稿日期：2015--

中图分类号：S852.5

文献标识码：B

文章编号：1005-7307(2016)04-0031-001