奶牛性控冻精技术的使用要点

王鸿周，施巧婷，朱肖亭，徐照学*

(1.河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州 450008；2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)



科技推广

奶牛性控冻精技术的使用要点

王鸿周1，施巧婷1，朱肖亭2，徐照学1*

(1.河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州 450008；2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

本文从种公牛选择、性控精液获得方法、管理、受配牛的选择以及人工授精等方面，介绍了如何更好地使用性控冻精为奶牛业的发展提供服务。

种公牛；性控冻精；人工授精；奶牛业

近年来中央一号文件都将“三农”作为首要关注问题，具体包括农民增收、提高农业综合 生产力、新农村建设等方面。而通过乳制品工业带动，大力发展奶牛养殖及其配套产业，对农村富余劳动力的有效平稳转移、广辟增收渠道、拓展增收空间、建设现代化农业具有重要意义。

目前，奶牛饲养管理水平低，饲料结构不合理；奶牛良种缺乏，品种不一，单产水平不高；原料奶品质不高，企业规模小；奶业科技投入不足，产业化程度有待提高，这是制约我国奶业的发展几个重大难题。目前推广奶牛群体改良的方法有三种：一是利用人工授精冻精技术体系；二是胚胎移植技术；三是引进国外良种奶牛。胚胎移植技术成本较高，且操作复杂，不适合大规模牛群改良。伴随人工授精技术出现的奶牛性控冻精技术，可以根据生产需要控制后代性别，利用高产优秀种公牛作为精液来源，与常规精液相比，使用性控冻精可以更快地得到大批的产奶量高、品质优秀的母牛后代，加快了良种奶牛的繁育进程,并提高了奶牛单产和牛奶品质。另外，研究表明，使用性控冻精不影响后代母牛的生长发育和繁殖性能，可以为养殖户带来明显的经济效益，因此，性控精液在奶牛育种生产中具有重要的作用。课题组经过在使用性控精液实验过程中不断总结经验以及查阅资料，总结出使用性控冻精技术的几个要点，以期为奶牛业的发展提供一定的理论基础。

1 把好源头关挑选合适的种公牛

优秀的种公牛是性控精液发挥作用的重要前提，种公牛优良生产繁殖性能的发挥及精液的品质高低与种公牛的种质和体质密切相关，种公牛不同则性控精液的分离效果也不相同，在鲜精活力相同的情况下，不同奶牛品种其精液的分离效果是不同的,一般奶牛的精液分离效果比乳肉兼用牛和肉牛分离效果好，青年公牛的精液分离和解冻效果也要优于老龄牛，另外，应激(热应激、疫苗注射)会对种公牛的精液品质和分离效果有很大的影响，热应激对种公牛的影响主要是促使种公牛体温升高，导致种公牛食欲减退，体况下降，引起阴囊皮温和睾丸温度升高，加之阴囊调节温度能力差，导致精子生成障碍。另外，口蹄疫疫苗注射对种公牛精子活率、精液废弃率及制冻数量也产生一定程度的影响，给精液生产造成一定的损失[1]。所以，在生产中，应挑选青年牛作为种公牛，合理安排防疫，夏季注意防暑降温避免热应激，做好种公牛的饲养管理工作。

应严把性控冻精的质量，根据提供性控冻精的种公牛系谱档案选择具有优秀遗传品质，无遗传缺陷的种公牛精液，并对肉牛个体的生殖系统发育情况、交配能力、性欲、射精量、精子形态、精子密度、精子活力和精液分离等进行检查，一般情况下，挑选原精活力高于75%的种公牛精液进行分离，若原精活力低于75%时，则分离效果和冻后活力效果不佳[2]。由于不同种公牛个体精子对分离处理的耐受性不同，所以，虽然有些种公牛个体精液品质优良，但分离效果差就不适合作性控精液分离，应挑选分离效果和冻后活力理想的种公牛进行性控冻精生产。有研究表明，种公牛的精子形态与受胎率有一定关系，发现头部越长越窄的精子，受胎率越高[3]。在生产中可以加强对有此类精子种公牛的挑选。

2 性控精液获得方法

目前，性控精液的获得方法主要是流式细胞仪法，此法依据X精子和Y精子头部DNA含量的差异以及荧光染料Hoechst33342可以特异性地与精子DNA螺旋相结合，从而将X精子和Y精子有效分离，有研究表明，牛精液中X精子和Y精子的DNA含量差异大更加容易分离，目前X精子的分离准确度可达90%以上。流式细胞仪分离法其主要流程包括采集精液-精液品质检测-合格者染色-流式细胞仪分离-性控精液冷冻-解冻。

在精液分离冷冻处理过程中，精细胞可能受到许多因素的干扰，如：采集到处理的间隔时间、高度稀释、核染色、机械压力(通过检索仪时、激光照射、离心、冷冻等)。有研究表明，采集到处理的间隔时间越长，分离处理的效果越差，间隔时间一般不应超过24小时，造成分离效果下降的原因，可能是在间隔时间内，环境因素会造成线粒体产生的活性氧(ROS)增加，较高的 ROS 水平将会使精子线粒体发生膨胀，诱导线粒体膜通透性发生改变，释放细胞色素C及其他凋亡相关因子损伤精子，损伤的精子又进一步增加 ROS 的生成，最终导致精液品质下降。另外，在精液冷冻解-冻过程中会造成部分精子的损伤和死亡，从而，产生更多对精细胞有害的ROS，精细胞的氧化损伤程度与精子冷冻效果有密切关系。为此，研究者一直以来，致力于研究精液冷冻保存的方法，探索选择合适的染色液、稀释液、鞘液、收集液、保存液、抗氧剂种类以及合适的冷冻保存方式，来提高精液冷冻保存的效果。稀释液的种类和配方对精液的冷冻效果非常重要，组成稀释液的主要成分包含糖类、盐类、蛋白类及一些抗冻保护剂。常用的糖类有葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖等，稀释液的糖类物质不仅为精细胞提供能量，还具有一定的防冻作用，甘油是一种常用的抗冻保护剂，因为甘油浓度对精子活力和顶体完整率有一定影响，对精细胞有一定的毒害作用，因此在运用中应注意控制其浓度。有研究发现，卵黄配合抗冻剂甘油对精液的冷冻保存也具有重要的作用。一般，卵黄的适宜添加量在15%～20%，再进行充分搅拌混匀。添加抗氧化剂主要是抑制精细胞内的自由基的生成，预防不饱和酸发生过氧化，从而对精细胞膜起到保护作用。添加的抗氧化剂种类主要有维生素和一些酶类，维生素C和维生素E在具有重要的抗氧化作用，Hu[4]等研究表明，稀释液中添加维生素E能够增强牛精子抗氧化酶活性，可以使精子冷冻-解冻后的质量得到提高，其添加的适宜剂量为1.5 mg/ml。赵宪林等[5]研究在冷冻稀释液中添加维生素C对荷斯坦种公牛X精子的影响发现，随着解冻时间的延长，维生素C能够减缓精子的死亡，而解冻时间短则效果不明显，其适宜添加量为4～6 mg/mL,并且发现荷斯坦公牛X精子在解冻后，其精子活率、质膜完整率及顶体完整率都有显著提高。赵宪林等[6]对奶牛性控冻精生产工艺进行改进发现，改进后的精子活率、顶体完整率、母牛受胎率、犊牛性别控制准确率以及精液中抗氧化物酶活性都有显著提高，在大幅度降低成本的同时加快了分离速度，并且提高了每支细管中的有效精子含量。值得注意的是，在冷冻处理前可以对精子进行优选，将死精畸形精进行剔除，可以有效降低冷冻处理后的死精数，使得ROS产生减少，从而提高精液品质。

3 管理要到位

牛场的正常运行主要是靠人来执行的，不管是大型牛场还是小型牛场，首先要建立一个统一的指挥系统，行使决策权，来有效地组织生产，协调各部门有序的工作，制定生产目标对生产活动进行计划、组织、指挥、协调和控制等一系列工作，保证生产顺利进行，并取得好的效益。明确分工，分配好各岗位的任务，各司其职，制定完善的的奖罚制度，并严格执行，做到奖罚分明，营造良好的工作环境和条件，使员工能够安心工作。没有不负责的人，只有制度的执行力不够和不完善，在完善的制度之下，牛场员工才能上下一心为牛场发展尽职尽责。

4 受配牛的选择和管理

奶牛性控冻精价格较高，奶牛场应慎重选择受配牛，就目前来说，应主要选择大于16月龄，体重中上等(350千克左右)，发情规律，体况良好的青年初配母牛作为受配牛，因其没有生理负担，营养状况和子宫内环境也相对较好，受胎率较高。一般牛场中对经产母牛的子宫维护工作往往不是太好，加之性控精液的精子活力也较低，往往导致受胎率偏低，并且影响繁殖周期，增加养殖成本。若要经产牛做受配牛，一定要选择发情周期正常，无流产、传染性疾病，营养状况良好，生殖道恢复正常，子宫内环境较好的高产奶牛，并且其受胎率最好在三胎以内。注意在选受配牛之前一定要注意对生殖疾病的检查，有病的牛坚决不用。

所选受配母牛应按照饲养标准进行统一的饲养管理，提前进行防疫接种，为避免受配母牛因营养不良，维生素及微量元素等缺乏所导致的受孕率低。日粮中必须注意添加矿物质和维生素，保证受配母牛日粮的全价性。

5 人工授精

5.1 受配母牛的发情鉴定

准确的母牛的发情鉴定对保证性控冻精的受胎率有重要影响，牛的发情时间短、情况复杂，应根据母牛生理特点正确掌握母牛性周期的规律，根据发情各阶段的特点，及时发现发情母牛，摸清排卵规律，识别异常发情，准确判定母牛发情所处时期，发情母牛主要表现为阴门肿胀、兴奋不安、频频排尿、内壁潮红、有粘液排出、不时发出叫声、嗅闻、接受爬跨和爬跨其他母牛，进入发情旺期后，被爬跨时站立不动。也可以通过直肠检查法来鉴定母牛的发情时期，发情母牛子宫会明显变软，并有稍微增大；卵巢变大；卵泡质地变软且有波动感，注意直肠检查切不可用力捏卵泡，手法要轻柔。

5.2 适时输精

性控精子在生殖道内保持受精能力约8 h，精子获能时间需2～4 h，最佳输精时间应在排卵前3～5 h输精，此时排卵后输精管内聚集的获能精子活力旺盛，增加了卵子的受精机会。有些散养户往往会因为发情观察不及时，而错过最佳的输精时间，导致受胎率下降。生产中一定要准确把握奶牛的发情时间，做好发情牛的记录，做到不漏配不复配。

5.3 做好消毒工作

输精前应将输精器械进行严格消毒，若连续输精，输精枪每次使用完毕，应用75%酒精棉球进行擦洗，再用吸水纸擦干输精人员的手臂也要进行消毒，使用正规的长臂手套，注意更换，做到每操作一头牛用一个手套，防止交叉感染。

5.4 解冻程序

冻精解冻要做到“三快”：快取、快投、快融解。从液氮罐中取出冻精细管，立即置于39～40℃水浴10～20s解冻。提取冻精时要迅速，提桶不得超出液氮罐口。取用时间超过 5 秒应将提桶放回液氮内，浸氮后再提取，以防冻精离开液氮时间过长，造成二次冻伤，影响精子活力，自水浴取出的细管，擦干后剪去一端装入输精枪，套上无菌塑料套膜。

5.5 输精

首先将发情母牛保定在配种架内，无条件的可将牛拴系于牛舍内或树桩上。输精员首先观察阴道内有无炎性分泌物流出，有病的则不能输精，留下记录，以后再做治疗处理。输精员左手戴一次性塑料长臂手套，外面淋润滑剂，如肥皂、石蜡油等，侧身站立于牛体后面，先用手抚摸肛门，五指并拢成锥状，以缓慢旋转的动作伸入直肠内，排除积粪。助手用肥皂水洗净外阴部并用一次性吸水巾擦干，或用75%酒精消毒并擦干，与此同时，开始进行精液解冻，并装枪，待装枪完毕交给输精员，然后助手站牛体侧面用双手拇指和食指各捏一半阴唇向上提拉，使输精员清楚看到阴道口，待输精员将输精器插入后，助手立即用手抓住牛尾向上绕圈再拉向一边，以有利于输精员输精操作。输精员用右手持输精器以30°角度(与水平面)通过阴唇插入阴道，当输精器碰到阴道上壁时，再以水平角度向前轻而缓慢地插入，避开尿道口，然后将左手伸入直肠内，沿前下方轻轻触摸，找到子宫颈并捏住子宫颈阴道端(注意不要把握过前，造成子宫口游离下垂，使输精器不易插入)，这时开始两手配合，右手把输精器前端送到左手所捏部位，然后左右手配合摇动，避免输精器停留在阴道穹隆，使输精器前端进入子宫颈口，有时阴道壁可阻止输精器插入，可通过后移输精器或把子宫颈前移再缓慢插入，左手继续前移改变子宫颈方向，使输精器越过褶壁轮，枪头插入子宫颈深部5～8 cm深的部位，注意不可盲目插入太深，以免弄破子宫内膜造成子宫出血，一般到达有卵泡侧子宫角基部或深部即可。这时，让助手或自己用右手将输精器内精液缓慢推出，随即慢慢抽出输精器。若精液推出受阻，可以将输精器稍向后退，并将精液注入。若发现输精枪上有大量精液残留，需要进行重新输精。待输精器抽出后，左手最好在直肠内停留几秒，对子宫颈进行按摩，可防止精液逆流。若遇到子宫颈难以插入的牛，可以用消过毒的扩宫棒进行扩张，然后再进行输精操作。不可对一只牛操作时间过长，若超过十五分钟还是难以插入就应放弃，以免损伤奶牛的子宫。

牛场内应挑选有责任心、工作经验丰富、对卵巢和子宫有熟练手感的的输精员，进行性控冻精的输精，不要经常更换配种员，严格遵守操作规程，做好配种记录，以防止近亲繁殖。在输精时也可同时肌注25μg LHRH-A3，可以显著提高奶牛性控精液人工授精的受胎率[7]。对于养殖户比较分散的地区，配种员应配备小型的液氮罐，将性控精液装在液氮罐里再到养殖户进行现场解冻，可以避免因为性控精液解冻后在外面停留时间过长，造成精液活力下降。

6 小结

牛性控冻精改良技术在生产实践中具有重大的利用价值，可以使养殖者获得更大的经济效益，现在，市场上性控冻精的价格还比较昂贵，加之有些地区基层优秀技术人员不足，饲养管理不当，生产管理粗放，影响性控冻精的推广应用。建议提高对性控冻精技术实践效果宣传力度，通过重点区域、重点小区的示范使用，使广大养殖户意识到性控冻精的使用价值，从而慢慢接受并使用性控冻精；政府各部门制定优惠政策，加大对奶牛养殖的扶持力度，调动奶农的养殖积极性[8]；加大对性控冻精技术的研究资金投入，着力降低性控冻精生产的成本。

目前，研究者也在致力于将性控冻精技术和其他技术结合起来的研究中，应用性控冻精和超排技术生产奶牛性控胚胎是可行的[9]，以低产奶牛、黄牛和肉牛作为受体，将高产奶牛的性控胚胎进行胚胎移植，可加速扩繁高产奶牛群。相信在未来的发展中，在政府和各级部门以及研究者、广大养殖户的共同努力下，我国奶牛业定会取得更大的成就。

[1] 赵永静.提高种公牛精液品质的几项措施[J].养殖技术顾问,2014,(10):54-56.

[2] 李艳华,朱玉林,薛建华等.牛性控精液分离效果影响因素分析[C].中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十六届学术研讨会论文集.2012:172.

[3] 王鸿周,施巧婷,王二耀等.提高肉牛冻精人工授精受胎率的几项措施[J].中国牛业科学,2014,40(4):78-80,86.

[4] Hu J H, Zhao X L, Tian W Q,et a1.Effects of vitamin E supplementation in the extender on frozen-thawed bovine semen preservation[J].Animal,2011,5(1):107-112.

[5] 赵宪林，昝林森，胡建宏等，维生素C对荷斯坦公牛X精子冻后品质的影响[J]．中国畜牧兽医，2010,37(4):121-124．

[6] 赵宪林,李耀坤,田万强等.奶牛性控冻精生产工艺改进及效果分析[J].中国牛业科学,2013,39(1):30-32,35.

[7] 李同豹,曲永利.提高奶牛性控精液受胎率的措施研究[J].中国奶牛,2011,(15):47-49.

[8] 韩瑞华，左建武，李景河等.铜川市奶牛性控冻精应用情况及存在的问题[J].黑龙江畜牧兽医(综合指导版)，2012,(1):83-84.

[9] 欧四海，王 刚，冯建丽等.应用性控冻精和超数排卵技术生产奶牛性控胚胎的效果分析[J].中国奶牛,2013,(5):34-36.

The Key Utilization Point of Dairy Cow Frozen Sex-control Sperm Technology

WANG Hong-zhou1, SHI Qiao- ting1, ZHU Xiao-ting2, XU Zhao-xue1*

(1.InstituteforAnimalHusbandryandVeterinary,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou,Henan450008,China;2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan, 450002,China)

This essay expounded that how to use frozen sex-controlled sperm technology to make the development of the dairy industry better from the bull selection, the obtained method and management of frozen sex-control sperm, the selection of receptor cow and artificial insemination.

breeding bull; frozen sex-control sperm; artificial insemination; dairy industry

2015-11-12修改日期:2015-11-30

王鸿周(1990-)，男，河南濮阳人，硕士，研究方向：家畜胚胎工程。

*通讯作者：徐照学(1961-)，男，陕西华县人，研究员，博士，主要从事家畜繁殖育种技术研究。E-mail:xuzhaoxue11@163.com。

S823.2

A

1001-9111(2016)01-0065-04