内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性与延边地区冠心病的相关性

朴丽梅　李玉子

(延边大学附属医院,吉林　延吉　133000)



内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性与延边地区冠心病的相关性

朴丽梅李玉子

(延边大学附属医院,吉林延吉133000)

摘要〔〕目的探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因G894T多态性与中国延边地区老年冠心病(CHD)的相关性。方法将研究对象分为正常对照组、CHD组、心肌梗死(MI)亚组，并根据病变累及冠脉血管支数分为单支、双支和多支病变组。采用聚合酶链式反应体外扩增目的基因片段后进行直接测序。结果CHD组、MI亚组与正常对照组基因型、等位基因分布比较差异显著(P<0.05)；朝鲜族CHD组与汉族CHD组基因型、等位基因分布比较无显著差异(P>0.05)；单支、双支与多支病变组基因型、等位基因分布比较无显著差异(P>0.05)；非MI亚组与MI亚组基因型、等位基因分布比较无显著差异(P>0.05)。结论eNOS G894T基因多态性与延边地区老年CHD和MI有关，T等位基因可能是其易感因素。

关键词〔〕冠心病；内皮型一氧化氮合酶；基因多态性

第一作者：朴丽梅(1987-)，女，硕士，主要从事冠心病研究。

冠心病(CHD)与环境因素有关，还与遗传危险因素有关，如内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因突变。目前研究证实与CHD关系较为密切的eNOS基因突变有G894T、T786C和4b/a。其中G894T变异于1998年首次被报道与吸烟依赖性冠状动脉痉挛(CAS)有关〔1〕，近年有对伊朗人群的研究显示，G894T突变是CHD的一个独立危险因素〔2〕。在其他不同国家、人群中也有研究显示其与心肌梗死(MI)有不同程度的关系。但目前尚无中国延边地区人群的相关报道。本实验旨在探讨eNOS基因G894T多态性与中国延边地区老年CHD的相关性。

1对象与方法

1.1研究对象2013年4月～7月就诊于我院心内科住院病房的受试者63例，年龄≥65周岁。均在住院期间完成冠状动脉造影检查,并根据累及冠脉血管支数定义为单只、双支及多只病变，冠脉狭窄病变累及左主干者记为双支病变。

1.2主要设备PCR仪，购自美国Bio-Rad公司；人基因组DNA提取试剂盒，购自美国Promega公司；PCR反应试剂，购自美国Promega公司；PCR Marker，购自日本Takara公司。

1.3血样的采集与处理每位受试者抽取桡动脉血约4 ml,加入含有EDTA-Na2抗凝剂的离心管中。离心吸取中间白细胞层并依次按照细胞裂解、核裂解、去除RNA、沉淀蛋白质的顺序提取DNA。

1.4PCR体外扩增目的基因片段PCR引物设计参照Hingorani等〔3〕，上、下游引物分别为：5′-CAT GAG GCT CAG CCC CAG AAC-3′；5′-AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA C-3′。PCR反应条件：预变性95℃，5 min 、变性95℃，30 s、退火59℃，50 s、延伸72℃，40 s、重复35个循环、最后延伸72℃，10 min。扩增产物与Marker一起电泳,可见片段长度为207 bp的扩增产物。见图1。

M泳道为1 000 bp的Marker,1～10泳道为样本PCR产物 图1　琼脂糖凝胶电泳检测目的基因扩增产物

1.5目的基因片段的测序目的基因片段扩增产物采用直接测序法，测序结果用Chromas软件进行分析,与人eNOS基因组第894位点比较，观察有无突变。

1.6统计学方法采用SPSS19.0软件进行χ2检验。

2结果

2.1Hardy-Weinberg平衡性检测人eNOS基因位于第7外显子第894 位点的鸟嘌呤(G)转换为胸腺嘧啶(T)，导致第298位的密码子由谷氨酸置换为天冬氨酸(Glu298Asp)，此基因突变前后的等位基因分别称G、T等位基因，突变后可产生杂合子(GT)和突变纯合子(TT)。 各组间基因型分布经χ2检验均符合Hardy-Weinberg平衡定律，不存在选择偏倚。

2.2eNOS基因G894T多态性与CHD、MI的关系CHD组与对照组基因型分布比较显示GG基因型频率低、GT+TT基因型频率高(P<0.05)；等位基因分布比较显示G等位基因频率低、T等位基因频率高(P<0.05)。MI亚组与对照组基因型分布比较显示GG基因型频率低、GT+TT基因型频率高(P<0.05)；等位基因分布比较显示G等位基因频率低、T等位基因频率高(P<0.05)。见表1。

2.3eNOS基因G894T多态性与朝鲜族、汉族CHD的关系朝鲜族CHD组与汉族CHD组基因型分布比较显示GG基因型频率低、GT+TT基因型频率高，但差异无统计学意义(P>0.05)；等位基因分布比较显示G等位基因频率低、T等位基因频率高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4eNOS基因G894T多态性与冠状动脉病变程度的关系单支、双支与多支病变组基因型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)；等位基因分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。MI亚组与非MI亚组基因型分布比较GG基因型频率低、GT+TT基因型频率高，差异无统计学意义(P>0.05)；等位基因分布比较G等位基因频率低、T等位基因频率高，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表1　三组各基因型、等位基因分布比较〔n(%)〕

与对照组比较：1)P<0.05

表2　朝鲜族与汉族CHD组各基因型、等位基因

表3　单支、双支与多支病变组各基因型、等位基因

表4　非MI亚组与MI亚组各基因型、等位基因

3讨论

内皮功能受损在冠状动脉粥样斑块形成及发展过程中作用显著，其释放的具有抗增生效应的内皮舒张因子中NO表现较为突出。近年研究显示在“L-精氨酸：NO” 通路中,关键酶NOS的一种亚型eNOS，其基因多态性与CHD关系较为密切。G894T突变可导致eNOS基因第298位的谷氨酸错译成天冬氨酸, 而此位谷氨酸正处于α-螺旋的中心，错译导致eNOS在此处的构象由α-螺旋变为紧密折叠,影响蛋白构型改变致其活性减低〔1〕。魏丹宏等〔4〕发表G894T多态性是导致CHD的一项危险因素。在韩国也有研究显示相比脑动脉粥样硬化G894T基因多态性在促进冠状动脉粥样硬化中的作用更大〔5〕,且在亚洲人群中这一特性尤为显著〔6〕。本研究提示在中国延边地区老年患者中，eNOS基因G894T多态性不仅与CHD有关，而且与MI关系密切。在国内对部分无年龄限制的汉族CHD人群的研究中也发现eNOS基因 G894T多态性中 T等位基因频率显著高于正常人〔7〕, GT、TT基因型较易发生MI〔8〕。在MI的临床治疗研究方面〔9,10〕，当外源性eNOS基因转至体内时NO含量增加，并刺激新生血管形成，且抑制转化生长因子Beta-1/Smad-2信号途径，最终对心肌梗死后心脏损伤起到保护作用。 在中国新疆维吾尔族、新疆蒙古族、新疆哈萨克族等同一地区、不同民族人群中eNOS基因G894T多态性不仅与CHD发生有关联，且其各自携带的基因型、等位基因频率也不尽相同〔11～13〕。而本研究提示eNOS基因G894T多态性在中国延边地区朝鲜族、汉族CHD之间无明显差异，无民族特异性。

本研究说明eNOS基因G894T多态性与CHD冠状动脉病变范围及冠状动脉粥样斑块稳定性均无关。这与Hingorani等〔3〕的研究结果一致，而与Gardemann等〔14〕的研究结果恰相反。提示有关eNOS基因G894T多态性与冠状动脉粥样硬化病变程度的关系在不同国家、种族或民族中或有差异性。

参考文献4

1Yoshimura M, Yasue H, Nakayama M,etal. A missense Glu298Asp X in the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with coronary spasm in the Japanese〔J〕. Hum Gene, 1998;103(1)：65-9.

2Salimi S, Firoozrai M, Zand H,etal. Endothelial nitric oxide synthase gene Glu298Asp polymorphism in patients with coronary artery disease〔J〕. Ann Saudi Med, 2010;30(1)：33-7.

3Hingorani AD, Liang CF, Fatibene J,etal. A common X of the endothelial nitric oxide synthase(Glu298→Asp)is a major risk factor for coronary artery disease in the UK〔J〕.Circulation, 1999;100(14)：1515-20.

4魏丹宏,单江,陈志妹.内皮型一氧化氮合酶基因G894T突变与中国人冠状动脉粥样硬化性心脏病的相关研究〔J〕.中华医学遗传学杂志,2002;19：471-3.

5Min BW, Na JY, Juhng SW,etal. A polymorphism (G894T) in eNOS increases the risk of coronary atherosclerosis rather than intracranial atherosclerosis in Koreans〔J〕. Acta Neurol Belg, 2010;110(3)：255-62.

6Tian GX, Zeng XT, Wang XB. Association between the endothelial nitric oxide synthase gene Glu298Asp polymorphism and coronary heart disease：A meta analysis of 39 case control studies〔J〕. Mol Med Rep, 2013;7(4)：1310-8.

7Rahimi Z, Nourozi-Rad R. Association of endothelial nitric oxide synthase gene variant (G894T) with coronary artery disease in Western Iran〔J〕. Angiology, 2012;63(2)：131-7.

8张爱元,季祥武,黄静,等.内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性与心肌梗死的相关性〔J〕.中国心血管病研究杂志,2007;5(1)：11-2.

9Smith RS Jr, Agata J, Xia CF,etal. Human endothelial nitric oxide synthase gene delivery protects against cardiac remodeling and reduces oxidative stress after myocardial infarction〔J〕. Life Sci, 2005;76(21)：2457-71.

10Chen LL, Yin H, Huang J. Inhibition of TGF-beta l signaling by eNOS gene transfer improves ventricular remodeling after myocardial infarction through angiogenesis and reduction of apoptosis〔J〕. Cardiovasc Pathol, 2007;16(4)：221-30.

11杨忠伟,冯秀丽,梁晓安,等.新疆维吾尔族冠心病患者eNOS基因G894T多态性分析〔J〕.农垦医学,2009;31(3)：224-6.

12冯秀丽，杨忠伟，江雪萍,等. 新疆蒙古族冠心病患者内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(16)：2261-2.

13陈春丽，江雪萍.新疆哈萨克族冠心病患者eNOS基因G894T多态性分析〔J〕.临床和实验医学杂志,2010;9(7)：499-500.

14Gardemann A , Lohre J, Cayci S,etal. The T allele of the missense associated with coronary heart disease in younger individuals with high atherosclerotic risk profile〔J〕. Atherosclerosis, 2002;160(1)：167-75.

〔2015-02-11修回〕

(编辑曲莉/滕欣航)

通讯作者：李玉子(1965-)，女，主任医师，硕士生导师，主要从事冠心病研究。

中图分类号〔〕R541.4〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6100-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.044