应用PCR-RFLP检测老年静脉血栓人群凝血酶原基因突变

曲兆洁　金　峰　史　磊　张　静　梁　迪

(吉林大学药学院，吉林　长春　130021)



应用PCR-RFLP检测老年静脉血栓人群凝血酶原基因突变

曲兆洁金峰1史磊1张静1梁迪

(吉林大学药学院，吉林长春130021)

摘要〔〕目的探讨汉族健康人群和老年静脉血栓病患者中G20210A突变的发生率。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术对某地区72例健康个体和43例老年静脉血栓患者进行G20210A基因突变研究分析。结果汉族健康个体和老年静脉血栓患者均未检出G20210A基因突变类型包括纯合子和杂合子。结论G20210A突变可能不是某地区汉族健康人群和老年静脉血栓病患者发病的主要危险因素。

关键词〔〕凝血酶原基因;突变;检测

1吉林大学第二临床医院

第一作者：曲兆洁(1991-)，女，在读硕士，主要从事天然药物化学研究。

凝血酶原基因中5'上游区和3'下游区为非编码区，对凝血酶原基因的表达起调控作用〔1〕。凝血酶原G20210A突变导致凝血酶原水平升高，造成血液高凝引起血栓〔2〕，如静脉血栓栓塞症(VTE)中的深静脉血栓(DVT)和肺血栓栓塞症(PTE)。本研究应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP技术)对某地区72例汉族健康人和43例老年静脉血栓病人进行了G20210A基因突变的研究分析。

1资料与方法

1.1研究对象随机抽取72例某地区无血缘关系的汉族健康人群静脉血1 ml，加乙二胺四乙酸(EDTA)K2抗凝，充分混匀后放入-20℃冰箱冷藏室保存。其中男42例，女30例，年龄30～62岁。另从我院收住的老年静脉血栓患者43例中抽取静脉血1 ml，同上处理，其中男22例，女21例，年龄50～74岁。

1.2主要仪器及试剂PCR仪，pros型，德国Eppendorf公司;凝胶成像分析系统，Gel Doc XR型，美国伯乐BIO-RAD公司；小型台式离心机Sigma1-14型，德国Sigma公司；血液基因组提取试剂盒(DP318)，购自天根生化科技(北京)有限公司，TaKaRa TaqTMHS Perfect Mix及HindⅢ内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3DNA的提取取冷藏保存的抗凝全血200 μl于1.5 ml离心管中，加入20 μl Proteinase K溶液，混匀，然后按试剂盒说明书进行操作，最后将DNA溶液收集到离心管中备用。

1.4PCR扩增参照文献〔3〕设计合成引物:上游引物5'- GCACAGACGGCTGTTCTCTT-3';下游引物:5'-ATAGCACTGGGAGCATTGAAGC-3'，PCR扩增反应体系为25 μl，其中DNA模板1 μl，2× mix 12.5 μl，上游引物0.5 μl，primer下游引物0.5 μl，补充ddH2O至25 μl。PCR扩增条件:95℃预变性1 min，95℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共33个循环，最后72℃ 延伸5 min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，并置凝胶成像仪上观察特异性条带，正常PCR扩增产物大小为506 bp，并记录实验结果。

1.5PCR-RFLP分析取上述成功扩增的PCR产物10 μl，10倍 Buffer:2 μl，Hind Ⅲ 限制性核酸内切酶1 μl，反应总体积20 μl，37℃酶切1 h后终止。用2%琼脂糖凝胶进行电泳，并于凝胶成像仪下观察酶切结果。

2结果

正常情况下的506 bp的PCR扩增片段中存在1个Hind Ⅲ限制性核酸内切酶的酶切位点，可将该片段切成407、99 bp两个片段(野生型)。若凝血酶原G20210A基因发生G→A突变，则出现一个新的Hind Ⅲ限制性核酸内切酶酶切位点，其中407 bp片段又被切成384、23 bp两个片段:故若为突变纯合子，则出现384、99、23 bp三条电泳条带:若为突变杂合子，则出现407、384、99、23 bp四条电泳条带。本实验分析结果显示:这72例汉族健康人群中凝血酶原G20210A基因均无该突变类型。结果表明该群汉族健康人无明显的差异，凝血酶原G20210A基因突变的发生率均为0。同样对血栓病患者的PCR产物以及经Hind Ⅲ限制性核酸内切酶酶切后的电泳图表明这43例老年血栓病人群也无明显的差异，凝血酶原G20210A基因突变的发生率也为0。部分样本电泳结果。见图1。

1～5:汉族健康人PCR 扩增产物;6～10为老年血栓病人PCR扩增产物；11～15为健康人PCR酶切产物，16～20为老年血栓病人PCR酶切产物；M为标准分子量Marker图1　PCR产物及经Hind Ⅲ 限制性核酸内切酶酶切凝胶电泳

3讨论

凝血酶原基因G20210A突变是遗传性易栓症领域在分子生物学研究中的一个重大发现〔4〕。Poort等〔2〕认为G20210A等位基因突变可使静脉血栓形成的危险性增加约3倍。Makris等〔5〕发现，凝血酶原G20210A等位基因在正常个体中的流行性仅0.66%，而有静脉血栓形成史者凝血酶原基因G20210A突变的发生率为7.9%。目前不同研究者得出G20210A基因突变发生率结果不同，可能因选择的研究人群不同所致。Zalavras等〔6〕研究发现G20210A突变使下肢DVT形成的风险性增加了2.7倍。Arruda等〔7〕研究结果认为凝血酶原基因G20210A突变可增加年轻女性心肌梗死发病的风险。

但凝血酶原基因G20210A突变是欧洲人群血栓性疾病的重要致病因素，国内研究结果未能证实这种相关性〔8〕。郭辰红等〔9〕关于凝血酶原基因G20210A突变与下肢DVT形成相关性研究中，发现86 例下肢DVT形成患者和100 例健康者中均未发现凝血酶原基因G20210A突变，该基因突变可能不是中国汉族人群下肢DVT的主要危险因子。本研究提示凝血酶原基因G20210A 突变可能与中国人VTE 发生关系不大，但由于该研究在中国的研究报道较少，这项研究的样本量不够大，因此还有待于进一步研究。血栓性疾病的形成与遗传性、后天获得性因素及环境密切相关〔10〕，因此，研究中国不同地区、不同民族群体中G20210A突变的存在情况，对于从分子水平阐明VTE发生的致病机制具有一定现实意义。

参考文献4

1Sandra A,Pagano RE.Phospholipid asymmetry in LM cell plasma membrane derivatives:polar head group and acyl chain distributions 〔J〕.Biochemistry,1978;17(2):332-8.

2Poort SR,Rosendaal FR,Reitsma PH,etal.A common genetic variation in the 3’-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis〔J〕.Blood,1996;88(10):3698-703.

3Huber S,McMaster KJ,Voelkerding KV.Analytical evaluation of primer engineered multiplex polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism for detection of factor V leiden and prothrombin G20210A 〔J〕.J Mol Diagn,2000;2(3):153-7.

4朱峰.遗传性易栓症中凝血酶原基因G20210A突变研究进展〔J〕.中华实用诊断与治疗杂志,2013;27(9):833-4.

5Makris M,Preston FE,Beauchamp NJ,etal.Co-inheritance of the 20210 aallele of the prothrombin gene increases the risk of thrombosis in subjects with familial thrombophilia 〔J〕.Thromb Haemost,1997;78(1):1426-9.

6Zalavras C,Giotopoulou S,Dokou E,etal.Prevalence of the G20210A prothrombin gene mutation in Northwestern Greece and association with venous thromboembolism 〔J〕.Int Angiol,2003;22(1):55-7.

7Arruda VR,Siquirea LH,Chiaparini LC,etal.Prevalence of the prothrombin gene variant 20210G→A among patients with myocardial infarction〔J〕.Cardiovasc Res,1998;37(1):42-5.

8魏旭倩，康懿，陈卫宾,等.上海地区人群抗凝蛋白C 基因突变和多态性研究〔J〕.临床输血与检验，2013;15(1)：34-7.

9郭辰红，郭琼行，龚瑶琴，等.凝血因子 V 基因 Leiden 突变和凝血酶原基因 G20210A 突变与下肢深静脉血栓形成关系的探讨〔J〕.山东大学学报(医学版)，2002;40(3):235-7.

10张佳,赵凤芹,谭平.凝血酶原基因 G20210A 突变与静脉血栓栓塞症相关性的研究进展〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(17):4361-4.

〔2014-11-22修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者：梁迪(1979-)，男，博士，讲师，主要从事药物合成研究。

中图分类号〔〕R543.6〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6074-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.030