胃泌素释放肽受体拮抗剂RC-3095对大鼠肺组织纤维化的干预作用

伍素霞　惠复兴

(张家港锦丰人民医院，江苏　张家港　215600)



胃泌素释放肽受体拮抗剂RC-3095对大鼠肺组织纤维化的干预作用

伍素霞惠复兴1

(张家港锦丰人民医院，江苏张家港215600)

摘要〔〕目的研究胃泌素释放肽(GRP)受体(R)拮抗剂RC-3095对大鼠肺组织纤维化的干预作用。方法构建肺组织纤维化大鼠模型，将大鼠随机分为正常对照组(NC组)、模型组(MO组)、RC-3095处理组(RC组，20 μg/d)，检测肺湿重、肺干重、肺系数，HE染色观察肺组织病理变化，酶联免疫吸附法检测肺组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量，Western印迹检测GRP、GRPR和转化生长因子(TGF)β1蛋白表达情况，免疫共沉淀检测GRP和GRPR相互作用情况。结果成功构建肺组织纤维化大鼠模型，MO组肺组织结构被破坏，肺泡间隔增厚，存在大量炎性细胞浸润；RC组肺组织结构较为完整，纤维化程度降低。同时MO组肺组织湿重、干重和肺系数均高于NC组，RC组肺组织湿重、干重和肺系数均高于NC组但是低于MO组(P<0.05)。MO组中Ⅰ型胶原含量高于NC组，Ⅲ型胶原含量低于NC组。RC组中Ⅰ型胶原含量低于MO组，Ⅲ型胶原含量高于MO组(P<0.05)。RC-3095处理可有效抑制GRPR和TGFβ1蛋白水平，同时抑制GRPR和GPR的结合。结论RC-3095可以通过调节GRP和GRPR的结合能力及TGFβ1的蛋白水平有效地抑制肺部纤维化。

关键词〔〕胃泌素释放肽受体拮抗剂；RC-3095；肺组织纤维化

1无锡市人民医院呼吸内科

第一作者：伍素霞(1966-)，女，副主任医师，主要从事呼吸内科疾病研究。

长期吸入含结晶型游离二氧化硅(SiO2)的粉尘可以导致严重的肺部弥漫性纤维化，即矽肺〔1〕。肺组织纤维化的发病机制往往是由于肺部组织中胶原代谢失调造成的〔2〕。目前对肺组织纤维化的治疗仍需要研发有效的治疗药物。胃泌素释放肽(GRP)是哺乳动物体内蛙皮素类似物之一，GRP通过与GRP受体(GRPR)结合调节细胞增殖、分化、炎症反应、癌症发生等多种生理病理过程〔3〕。RC-3095是GRPR拮抗剂之一，本文主要研究RC-3095对大鼠肺组织纤维化的干预作用及临床应用价值。

1材料与方法

1.1动物分组与模型建立30只健康成年大鼠，由本院动物中心提供，本实验通过本院伦理协会同意。平均体重(258±32.15)g，随机分为正常对照组(NC组)、模型组(MO组)、RC-3095处理组(RC组)。大鼠经0.4%戊巴比妥麻醉后，采用非暴露式气管内注入法，注入1 ml SiO2混悬液(40 mg/ml)，用手轻拍大鼠两侧胸壁，使粉尘分散至全肺。NC组注入同体积生理盐水。建立矽肺模型后，RC每日腹腔注射20 μg/d RC-3095，NC组和MO组注射等体积生理盐水。所有实验动物均SPF级动物房中分笼饲养，饮水饲料笼具和所有操作用品均灭菌处理后使用。

1.2肺组织病理分析培养4 w后处死大鼠，收集肺部组织用于检测肺湿、干重、肺系数及肺组织病理学分析。肺湿、干重的测定方法：剪下肺叶，用滤纸吸干，称湿重后置 110℃干燥箱内烘干至恒重。肺系数按照以下公式计算：肺系数=肺湿重(mg) /体重(g)×100%。将部分左肺叶置于 4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋、切片后行苏木素-伊红(HE)染色及免疫组化检测。

1.3ELISA法检测肺组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量取肺组织50 g，液氮中充分研磨后，利用上海生工生物有限公司Ⅰ型和Ⅲ型胶原ELISA试剂盒检测，操作按照说明书进行。

1.4Western印迹检测GRP、GRPR和TGFβ1蛋白表达情况取肺组织50 g，液氮中充分研磨后，利用美国天根公司蛋白裂解液裂解获得蛋白样品，利用Western免疫印迹检测肺组织中细胞内GRP、GRPR、转化生长因子(TGF)β1的蛋白表达水平。GRP、GRPR、TGFβ1抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.5免疫共沉淀检测GRP和GRPR相互作用情况取肺组织50 g，液氮中充分研磨后，利用美国天根公司蛋白裂解液裂解获得蛋白样品，加入5 μl GRP抗体，4℃孵育12 h，加入蛋白A (天根公司)孵育6 h后，用蛋白裂解液洗3次，每次10 min，4℃ 5 000 r/min离心1 min，收集珠子，加入20 μl上样缓冲液，100℃煮5 min，利用GRPR抗体(美国SANTA公司)进行Western印迹实验。

1.6统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行t、χ2检验。

2结果

2.1肺组织病理学改变NC组肺组织结构完整，肺泡腔内无炎性细胞浸润，肺泡间隔无充血、水肿及增厚等现象；MO组肺组织结构被破坏，肺泡间隔充血水肿存在增厚现象，肺泡腔及肺间质内存在大量炎性细胞浸润；RC组肺组织结构较为完整，与MO组相比炎症细胞浸润程度较轻，肺泡间隔增厚现象不明显。见图1。MO组肺组织湿重〔(4.23±0.57)g〕、干重〔(1.73±0.46)g〕和肺系数(12.27±0.48)均明显高于NC组〔(1.53±0.34)g、(0.73±0.12)g、(5.11±0.39)〕，RC组肺组织湿重〔(2.11±0.36)g、干重(1.22±0.27)g和肺系数(8.47±0.38)〕均高于NC组但是显著低于MO组(P<0.05)。

图1　各组肺组织病理学改变(HE，×20)

2.2肺组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量MO组中Ⅰ型胶原含量〔(82.28±0.36)%〕明显高于NC组〔(32.15±2.21)%〕，RC组中Ⅰ型胶原含量〔(46.15±0.36)%〕高于NC组但明显低于MO组。MO组中Ⅲ型胶原含量〔(14.37±0.35)%〕明显低于NC组〔(31.63±2.37)%〕，RC组中Ⅲ型胶原含量〔(27.38±0.3)%〕明显低于NC组但明显高于MO组(P<0.05)。

2.3RC-3095对GRP和GRPR相互作用的影响MO组中GRP和GRPR相互作用与NC组无显著差异。说明RC-3095降低了GRP和GRPR的结合。见图2。

图2　RC-3095对GRP和GRPR相互作用的影响

2.4RC-3095对GRP、GRPR和TGFβ1蛋白水平的影响RC组、NC组和MO组的GRP蛋白水平无显著性差异，MO组GRPR蛋白水平高于NC组，RC组GRPR蛋白水平低于MO组，与NC组无显著性差异。TGFβ1蛋白水平与之相反，MO组TGFβ1蛋白水平低于NC组，RC组TGFβ1蛋白水平高于MO组和NC。见图3。

图3　3组GRP、GRPR和TGFβ1蛋白水平

3讨论

肺部纤维化是可由多种病因造成的共同现象，目前常见的导致肺部纤维化的原因有吸入SiO2等有毒物质、受到放射性损伤等，肺部纤维化也是导致急性呼吸系统综合征(SARS)患者死亡的重要原因之一〔4，5〕。肺部纤维化后，炎症细胞浸润肺泡组织，纤维细胞聚集，胶原沉积使得肺泡结构组织改变，肺间质增宽，显微组织和毛细血管增生，继而无法完成正常肺功能，导致患者死亡〔6〕。Ⅰ型胶原纤维粗，硬度和抗牵拉能力较强，而Ⅲ型胶原纤维较细，具有较好的伸展性和弹性〔7〕，Ⅰ型胶原含量增加而Ⅲ型胶原含量降低说明肺组织纤维化程度增强。

GRP是一种重要的细胞因子，参与促进生长、调节胃肠运动和激素分泌、昼夜节律等生理过程，并且与炎症反应和癌症发生发展有关〔8〕。GRP发挥作用主要通过结合其受体GRPR进行。在癌症治疗中，以GRP/GRPR为靶向可以明显提高药物的有效靶向传递，降低肿瘤耐药和化疗药物的不良反应，可下调生长因子的水平，抑制血管生成信号通路、调节细胞增殖与凋亡的功能〔9〕。本文说明GRPR蛋白在肺部纤维化中可能发挥着重要作用。

RC-3095是GRP/GRPR通路的拮抗剂，由于RC-3095与GRP具有类似的结合能力，因此可以拮抗GRP与GRPR的结合，目前研究表明RC-3095在多种癌症中具有抑制细胞增殖，降低炎症反应的功能，如结肠癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌等，同时也有化学预防剂的功能〔10〕。本文说明RC-3095可以有效地抑制肺部纤维化。RC-3095可以有效抑制肺纤维化大鼠中GRPR蛋白表达水平，但是对GRP蛋白水平无显著影响，此外RC3095降低了GRPR和GRP的相互作用。肺纤维化过程包括肺组织的炎性损伤、组织结构破坏及随后伴有肺间质细胞积聚的组织修复过程。这个过程中有多种细胞因子参与，TGFβ1是目前已知的最强的致纤维化因子〔11〕，RC-3095可以通过调节GRP和GRPR的结合能力及TGFβ1的蛋白水平抑制肺部纤维化。

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〔2014-07-06修回〕

(编辑苑云杰)

基金项目：江苏省卫生厅指导性科研课题(No.Z201310)

中图分类号〔〕R563.9〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6039-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.015