两品系小鼠局部淋巴结试验结果比较

胡培丽，张露勇，李　波，邢书霞

(中国食品药品检定研究院，北京　100050)



两品系小鼠局部淋巴结试验结果比较

胡培丽，张露勇，李波，邢书霞

(中国食品药品检定研究院，北京100050)

【摘要】目的分析比较BALB/c和CBA小鼠局部淋巴结试验结果。 方法 将已知致敏性的4种化学物(2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、己基肉桂醛和异丙醇)和未知致敏性的3种化妆品对BALB/c和CBA小鼠连续染毒3 d，第5天腹腔注射示踪剂BrdU，第6天分离颌下淋巴结制取单细胞悬液，用ELISA试盒检测细胞增殖。 结果 2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、己基肉桂醛和3号烫发剂两品系结果均呈致敏阳性，3种化学物EC1.6值分别为0.08%(极强)、4.02%(中)、6.68%(中)(BALB/c)和0.07%(极强)、6.08%(中)、8.89%(中)(CBA)；异丙醇、1和2号化妆品两品系结果均为致敏阴性，SI均小于1.6。 结论 两品系小鼠局部淋巴结试验结果较一致，BALB/c可替代CBA小鼠应用于化学物和化妆品的致敏性评价。

【关键词】局部淋巴结试验；品系；化妆品

小鼠局部淋巴结试验(local lymph node assay，LLNA)是皮肤致敏性多种替代方法中应用最为广泛的全球标准方法[1-3]，但该方法需要使用放射性标记物、特定的设备和实验条件，不利于推广；2010年OECD指南公布了基于掺入溴脱氧尿嘧啶核苷和酶联免疫吸附测定的改良方法(LLNA:BrdU-ELISA)[4]，用示踪剂替代放射性标记物，较易推广。该指南中推荐使用CBA小鼠，由于该品系小鼠在国内供应量较少，价格昂贵，给国内很多学者开展该试验带来了一定的困难。鉴于国内外有使用BALB/c、NMRI、ICR、DBA/2、C57BL/6、SJL等品系的报道[5-10]，而BALB/c小鼠是国内应用较多的品系，遗传稳定，本实验尝试分析比较国内BALB/c和CBA两品系小鼠对LLNA:BrdU-ELISA实验结果的影响，从而为LLNA实验选择合适的动物品系提供参考。

1材料和方法

1.1受试物

溶剂由丙酮/橄榄油(AOO)(4∶1 v/v)配制而成，2,4-二硝基氯苯(DNCB)(中国医药总公司北京分公司)与异丙醇(IPA，北京化工厂)分别用AOO配成0.1% (w/v)、0.3% (w/v)、1.0% (w/v) 和25%(v/v)、50%(v/v)、100%(v/v)3个浓度；丁子香酚(EUG)与己基肉桂醛(HCA)均购自Sigma公司，均用AOO配成25%(v/v)、50%(v/v)2个浓度；3种化妆品原液直接涂抹于小鼠耳背皮肤。

1.2实验动物

SPF级BALB/c和CBA小鼠，雌性，8～10周龄，分别由中国食品药品检定研究院实验动物资源中心和北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号分别为【SCXK(京)2009-0017】、【SCXK(京)2009-0004】。动物试验环境为中国食品药品检定研究院屏障系统动物房【SYXK(京)2011-0008】，温度(22±2)℃，湿度50%～70%，动物自由饮食，12 h人工照明。

1.3试剂和仪器

BrdU粉剂与BrdU-ELISA试剂盒均购自德国Roche公司(编号10280879001、11647229001)。BrdU标记液用生理盐水配制成10 mg/mL。SYNERGY HT型全自动酶标仪(美国BIO TEK 公司)、CR22G III型低温离心机(日本HitacHi公司)。

1.4方法

1.4.1动物分组和染毒[4, 11]

动物随机分为4只/组，4种化学物(己基肉桂醛、丁子香酚、2,4-二硝基氯苯、异丙醇)分别设为2～3个不同剂量组，共用一个AOO溶剂对照组；3种化妆品(1号精华霜、2号防晒霜、3号烫发剂)分别设一个最高剂量组，共用一个蒸馏水对照组。将受试物25 μL/耳/d涂抹于小鼠双耳背部皮肤，连续涂抹3 d，对照组涂抹AOO或蒸馏水，第4天不处理，第5天腹腔注射BrdU标记液0.5 mL，第6天处死动物分离颌下淋巴结。

1.4.2淋巴细胞制备[4, 11]

BrdU标记液腹腔注射后24 h，处死动物，摘取颌下淋巴结，研磨后用不锈钢筛网(200目)过滤制成单细胞悬液，PBS洗2次(离心1200 r/min，8 min)，每只小鼠的淋巴细胞定容于14 mL PBS中。

1.4.3ELISA检测细胞增殖

将细胞悬液100 μL /孔加至96孔板中，离心(1400 r/min，10 min)，弃上清，吹干细胞。经ELISA试剂盒处理后用酶标仪检测Brdu值(发射波长和参考波长分别为370 nm，492 nm)，BrdU标记指数为(A370-A空白370)-(A492-A空白492)。

1.4.4SI、EC1.6值计算与致敏性分级

刺激指数( stimulation index，SI)=受试物组BrdU标记指数均值/溶剂对照组BrdU标记指数均值；SI≥1.6，并有剂量-效应关系，该受试物为致敏阳性[4, 11]。根据SI计算EC1.6值和致敏级别，计算公式为[11]：①EC1.6=c+[(1.6-d)/(b-d)]×(a-c)(受试物各浓度组对应SI值包括>1.6和<1.6)，②EC1.6=2^{log2(c)+[(1.6-d)/(b-d)]×[log2(a)-log2(c)]}(受试物各浓度组对应SI值均>1.6)，其中设a、c为邻近两点受试物的浓度，b、d为对应的SI值；当SI=1.6时，其对应的受试物浓度即为EC1.6值。分级标准为：EC1.6%<0.1极强，0.1≤EC1.6%<1.0强，1.0≤EC1.6%<10中,10≤EC1.6%<100弱[11]。

2结果

2.1染毒期间动物状态观察

染毒期间动物正常饮食，体重增长良好。部分组别(1% 2,4-二硝基氯苯)小鼠染毒部位出现水肿、红斑或结痂刺激性或致敏性症状，各脏器未见有任何病变，未观察到明显的其他毒性症状。

2.2两品系小鼠BrdU标记指数和刺激指数SI值比较

由表1可见，BALB/c和CBA小鼠：AOO和蒸馏水对照组的BrdU标记指数较一致，淋巴结增生程度均较低；3种已知致敏物(2,4-二硝基氯苯，丁子香酚和己基肉桂醛)各浓度SI均大于1.6，且均有明显的剂量-反应关系；非致敏物异丙醇各浓度SI均小于1.6，与有关文献报道一致[11]。1、2号化妆品SI均小于1.6，判断为无致敏性，3号染发剂SI大于1.6，为致敏阳性。

表1　两品系小鼠对4种化学物和3种化妆品LLNA:BrdU-ELISA测定结果

注：VS: 极强；M：中。

Note: VS: very strong; M: moderate.

2.3两品系小鼠EC1.6值与致敏性分级比较

两品系小鼠：2,4-二硝基氯苯EC1.6值较相近，为极强致敏物；丁子香酚和己基肉桂醛EC1.6值不是很一致，但均在1～10范围内，为中等强度致敏物(表1)。

3讨论

由于实验动物的种属、性别、年龄等差异影响实验结果，因此选择合适的实验动物进行相关实验尤为重要。OECD指南(TG429、TG442)推荐使用CBA雌性小鼠，给国内各毒理实验室推广该LLNA方法带来了困难。BALB/c小鼠是国内应用较多的近交系，遗传背景明确、稳定，国内外已有学者将BALB/c小鼠应用于LLNA研究[5-10]，但目前国内外关于该两品系小鼠LLNA:BrdU-ELISA法评价化学物和化妆品致敏性的比较研究还未见相关报道。

本研究将BALB/c和CBA小鼠分别对不同致敏强度的4种化学物和3种化妆品进行评价，结果两品系对AOO和蒸馏水溶剂对照反应均较低，对2,4-二硝基氯苯、丁子香酚和己基肉桂醛和3号烫发剂反应均呈致敏阳性(SI>1.6)，且3种化学物剂量-反应关系显著；对异丙醇和1、2号化妆品反应均呈致敏阴性(SI<1.6)。

从表1中我们可以发现CBA小鼠BrdU标记指数和刺激指数SI值均偏高于BALB/c，推断CBA小鼠较BALB/c表现出更高程度地BrdU摄取，但两品系对4种化学物和3种化妆品的致敏性判断一致，虽然2,4-二硝基氯苯、丁子香酚和己基肉桂醛的EC1.6值存在差异，但致敏强度分级均一致，表明该两品系小鼠只是反应程度有一定的差异，对化学物和化妆品致敏性判断及致敏强度分级并无显著影响。国际上也有学者将不同品系小鼠进行了LLNA研究[5-6,12]，其结果与本研究一致。

综上，BALB/c和CBA小鼠LLNA: BrdU-ELISA试验结果较一致，均可较好地评价化学物和化妆品的致敏性，BALB/c小鼠可替代CBA在国内各毒理实验室推广应用于化妆品皮肤致敏性评价。

参考文献：

[1]OECD.OECD guideline for the testing of chemicals skin sensitazation: local lymph node assay 429 [S/OL].2002. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llnadocs/OECD 429.pdf.

[2]Boverhof DR, Gollapudi BB, Hotchkiss JA,etal. Evaluation of a toxicogenomic approach to the local lymph node assay (LLNA) [J]. Toxicol Sci, 2009, 107 (2): 427-439.

[3]Haseman JK, Strickland J, Allen D,etal. Safety assessment of allergic contact dermatitis hazards: an analysis supporting reduced animal use for the murine local lymph node assay [J]. Regul Toxicol Pharmacol. 2011, 59 (1):191-196.

[4]OECD.OECD guideline for the testing of chemicals skin sensitization: local lymph node assay: BrdU-ELISA [S/OL]. 2010.

http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/suppdocs/feddocs/oecd/oecd-tg442b.pdf.

[5]Woolhiser MR, Munson AE, Meade BJ. Comparison of mouse strain using the lymph node assay [J]. Toxicology, 2000, 146 (2-3): 221-227.

[6]Ehling G, Hecht M, Heusene A,etal. An European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: First round [J]. Toxicology, 2005, 212 (1): 60-68.

[7]刘协，吕中明，施伟庆，等．BALB/c和ICR小鼠用于局部淋巴结试验的研究[J]. 江苏预防医学, 2009, 20(1): 4-6.

[8]何国群，杨杏芬，郑穗生，等. 溴脱氧尿嘧啶核苷掺入法作为皮肤致敏试验替代方法研究[J]. 中国职业医学, 2011,38(5): 377-380.

[9]阳晓燕，赵康峰，孔建，等. 局部淋巴结改良法在化妆品皮肤刺激性和致敏性检测中的应用[J]. 环境与健康杂志, 2013, 30 (4): 312-316.

[10]胡培丽，罗飞亚，陈志蓉，等. LLNA: BrdU-ELISA改良法的建立及其在化妆品安全性评价中的应用[J]. 中国比较医学杂志, 2014, 24 (9): 23-27.

[11]ICCVAM. Test Method Evaluation Report: The Murine Local Lymph Node Assay: BrdU-ELISA, a Nonradioactive Alternative Test Method to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products [R]. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. NIH Publication, 2010. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm.

[12]Kimber I, Hilton J, Dearman RJ,etal. An international evaluation of the murine local lymph node assay and comparison of modified procedures [J]．Toxicology, 1996, 103 (1): 63-73.

〔修回日期〕2015-03-31

技术方法

The comparative study of two strains on results of Local lymph node assays

HU Pei-li，ZHANG Lu-yong，LI Bo，XING Shu-xia

(National Institutes for food and drug control，Beijing 100050，China)

【Abstract】ObjectiveTo analyze and compare results of local lymph node assays (LLNA) between BALB/c and CBA mice. Methods 4 chemicals (2,4-dinitrochlorobenzene, eugenol, hexyl cinnamic aldehyde and isopropanol) and 3 cosmetics were applied to the dorsum of both ears of Balb/c and CBA mice for three consecutive days. BrdU solution was injected inter-peritoneally on day 5. On day 6, the bilateral draining auricular lymph nodes were excised and made into single cell suspension, the lymph cell proliferation was measured by BrdU ELISA kit. Results2,4-dinitrochlorobenzene, eugenol, hexyl cinnamic aldehyde and NO.3 perm agent pretended positive for both strains, EC1.6 values of three chemicals were found to be 0.08% (very strong), 4.02% (moderate), 6.68% (moderate) and 0.07% (very strong), 6.08% (moderate), 8.89% (moderate) for BALB/c and CBA mice respectively. Isopropanol, NO.1 and NO.2 cosmetics pretended to be non-sensitizers with SI<1.6 for both strains. Conclusion This study showed that BALB/c mouse was essentially equal to CBA for LLNA: BrdU-ELISA, which suggested that BALB/c mouse was a good alternative for CBA used in chemicals and cosmetics allergenic evaluation.

【Key words】Local lymph node assay；Strain；Cosmetics

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.013

【中图分类号】R758.22R332

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856(2015) 05-0054-04

[作者简介]胡培丽(1981-)，女，硕士，助理研究员，研究方向：食品化妆品安全性评价，E-mail： hupeili-1981@163.com。

[基金项目]中检院中青年基金项目(2013NC3)。