重组抗VEGF人源化单克隆抗体F0001的临床前主要药效学研究

王罗春 瞿爱东 楼丽广

摘 要 目的：评估重组抗VEGF人源化单克隆抗体F0001的临床前主要药效学及与原研药安维汀的生物类似性。方法：从体外作用机制及活性、体内抑瘤作用、及对荷瘤小鼠PK/PD等方面进行研究。结果：F0001明显抑制VEGF刺激的KDR磷酸化及下游因子ERK1/2磷酸化；抑制HUVEC细胞增殖，IC50为123 ng/ml。F0001 5 mg/kg显著抑制人结肠癌Ls-174t、肺癌NCI-H460和恶性胶质瘤U-87MG裸小鼠皮下移植瘤生长，抑瘤率分别为68%、68%和86%；与化疗药CPT-11合用对人结肠癌Ls-174t有抑瘤增效作用，抑瘤率提高到89%。F0001与安维汀体外作用机制及活性相当、体内抑瘤效果相当，二者在人结肠癌Ls-174t荷瘤小鼠体内PK/PD参数相似。结论：F0001与原研药安维汀在主要药效学方面高度类似。

关键词 重组抗VEGF人源化单克隆抗体 安维汀 抑瘤率

中图分类号：R965； R979.19 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）13-0055-06

Preclinical pharmacology of recombinant anti-VEGF humanized monoclonal antibody F0001*

WANG Luochun1**， QU Aidong2***， LOU Liguang3****（1. Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China； 2. Shanghai Institute of Biological Products Co.， Ltd.， Shanghai 200051， China； 3. Shanghai Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the preclinical pharmacology of recombinant anti-VEGF humanized monoclonal antibody F0001 and its biological similarity to the original drug Avastin. Methods： F0001 was evaluated for its mechanism of action， antitumor activity in vitro and in vivo， and PK/PD in tumor-bearing nude mice. Results： F0001 could significantly inhibit VEGF-stimulated KDR and downstream factor ERK1/2 phosphorylation， and VEGF-stimulated HUVEC proliferation with IC50 of 123 ng/ml. F0001 at 5 mg/kg could significantly inhibit the growth of human colon cancer Ls-174t， lung cancer NCI-H460 and malignant glioma U-87MG tumors subcutaneously transplanted into nude mice with the tumor inhibition rate of 68%， 68% and 86%， respectively. Combination of F0001 with chemotherapy drug CPT-11 produced synergistic antitumor effect in Ls-174 xenografts with the tumor growth inhibition of 89%. Conclusion： The mechanism and activity of F0001 in vitro and in vivo are similar to Avastin and their PK/PD parameters are similar in human colon cancer Ls-174t tumor-bearing mice. The main preclinical pharmacology of F0001 is very similar to that of original drug Avastin.

KEy WORDS recombinant anti-VEGF humanized monoclonal antibody； Avastin； tumor inhibition rate

安維汀（贝伐珠单抗注射液， Avastin）是美国基因技术公司和罗氏制药公司开发的一种抗人血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的人源化单克隆抗体药物，与化疗药合用，用于治疗转移性结直肠癌、非小细胞肺癌、转移性肾细胞癌、脑胶质瘤、晚期子宫颈癌、铂耐药复发性卵巢癌、转移性Her2阴性乳腺癌等[1-2]；2010年2月也获准在我国上市，用于治疗转移性结直肠癌及非小细胞肺癌[3]。因此，安维汀是一种广谱性抗癌药物，临床价值巨大。但其价格高昂，极大地限制了在我国临床使用的可及性。

复旦张江公司研制的重组抗VEGF人源化单克隆抗体F0001是安维汀的生物类似候选药物。本研究从F0001的体外作用机制及活性、体内对裸小鼠荷人结肠癌Ls-174t或肺癌NCI-H460或恶性胶质瘤U-87MG的抑瘤活性、以及在荷瘤裸小鼠的体内代谢动力学（pharmacokinetics based on pharmacodynamic drug concentration，PK/PD）等方面[4-7]，研究了F0001的临床前主要药效学作用及其与原研药安维汀的生物类似性，以便为本品临床研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试药物

重组抗VEGF人源化单克隆抗体（简称F0001）注射液（上海复旦张江生物医药股份有限公司研制，批号20140701）；安维汀（Roche Pharma （Schweiz） Ltd.，批号H0125B03、 H0132B04，使用前将供试药用培养液或含0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的生理盐水稀释至适当浓度，置2～8 ℃冰箱保存备用）；盐酸伊立替康（CPT-11）（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号616130304，使用时用生理盐水配制。

1.2 试剂、仪器及细胞株

胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司；培养基M199/RPMI 1640购自Gibco BRL公司；VEGF165购自R&D Systems公司；phospho-ERK1/2 antibody及ERK1/2 antibody购自Cell Signaling Technology公司；b-tubulin antibody购自Sigma公司；抗兔IgG二抗，抗小鼠IgG二抗购自Calbiochem公司；PVDF膜及ECL检测试剂盒购自Millipore公司；磺酰罗丹明B（SRB）购自Sigma公司；Synergy H4多功能酶标仪购自BioTek公司。

人脐静脉血管内皮细胞株（HUVEC）（美国ATCC，用含20 mg/ml ECGS、20% FBS的M199培养2～6代进行实验）；人结肠癌Ls-174t细胞株/肺癌NCI-H460细胞株/恶性胶质瘤U-87MG细胞株均购自美国ATCC，均用含有青霉素、链霉素、及10% FBS的RPMI 1640培养。

1.3 实验动物

BALB/cA裸小鼠，雌性，6～7周，分別购自上海灵畅生物科技有限公司，合格证号2013001801920、2013001804063；上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号2007000572618、2007000571898、2007000-573259。

1.4 试验方法

1）对VEGF刺激的VEGFR2/KDR信号作用（Western blot法）[4，8] HUVEC接种于六孔板中，将不同浓度（0.001～10 mg/ml）F0001或安维汀与50 ng/ml VEGF预孵育30 min，再作用于HUVEC 5 min，然后收集细胞裂解。细胞裂解物在沸水浴中加热变性。取上清液进行SDS-PAGE电泳，而后用湿转系统将蛋白转移至硝酸纤维素膜，将膜置于一抗溶液中温育，再用含TBS/T洗涤。将膜置于二抗溶液中室温反应1 h；同上洗膜三次后，用ECL试剂发色、显影。

2）对HUVEC细胞增殖生长的抑制作用（SRB法）[4，9] 接种一定数量对数生长期HUVEC于96孔培养板，贴壁生长24 h，将不同浓度（0.3～3 000 ng/ml）F0001或安维汀与40 ng/ml VEGF预孵育30 min，再作用于HUVEC。每浓度设复孔，同时设相应浓度溶媒对照。然后将HUVEC于37 ℃、5% CO2条件培养72 h。SRB染色，加入CCK-8溶液，37 ℃放置4 h。用酶标仪于450 nm波长下测定OD值，应用公式：抑制率 =（对照孔细胞OD值-给药孔细胞OD值）/对照孔细胞OD值×100%，计算细胞生长抑制率及半数抑制浓度IC50。

3）对裸小鼠皮下移植瘤的疗效[4，7] 裸小鼠分别皮下接种人结肠癌Ls-174t细胞或人肺癌NCI-H460细胞或人恶性胶质瘤U-87MG细胞，待肿瘤生长至100～150 mm3后，将各类荷瘤动物分别随机分组后给药（D0），给药剂量和给药方案见表1。每周测瘤体大小2～3次，称鼠重，记录数据，计算肿瘤体积及抑瘤率。

肿瘤体积（V）计算公式：V=1/2×a×b2，其中 a、b分别表示瘤长、瘤宽；

根据测量结果计算相对肿瘤体积（RTV），RTV=Vt/V0，其中V0为分笼给药时（即D0）所测得的肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体积。

应用公式T/C（%）=（T-T0）/（C-C0）×100%，计算抑瘤率；抑瘤率（%）=100%-T/C（%）。其中T、C为实验结束时给药组、生理盐水组的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时给药组、生理盐水组的肿瘤体积。

当肿瘤出现消退时，抑瘤率（%）=100%-（T- T0）/T0×100%。如果肿瘤比起始体积缩小，即T

4）对裸小鼠的代谢动力学[4，10] 裸小鼠皮下接种人结肠癌Ls-174t细胞，待肿瘤生长至200～300 mm3后，将动物随机分组，分别单次静脉注射F0001或安维汀1.5和5 mg/kg，给药后5 min、4 h、24 h，48 h、72 h、96 h、168 h，各取4只小鼠，眼眶采集全血，凝血后离心采集血清；同时取肿瘤组织。血清、肿瘤组织于-80 ℃保存，最终检测药物浓度。

2 结果与分析

2.1 对VEGF刺激的VEGFR2/KDR信号的抑制作用

如图1所示，VEGF显著诱导高表达KDR的HUVEC细胞中的KDR磷酸化（左起，第2列）；F0001在1 mg/mL能明显抑制VEGF刺激的KDR磷酸化及下游因子ERK1/2磷酸化，其抑制活性与参比抗体安维汀相当。

注：左起第2列显示，VEGF诱导HUVEC细胞的KDR信号通路磷酸化，即P-KDR条带变深；以及其下游信号ERK1/2的磷酸化，即P- ERK1/2条带变深。随着F0001剂量的增加（左起第3～7列），由于其对VEGF的中和抑制作用，VEGF诱导的磷酸化效应逐步减弱，即P-KDR、P- ERK1/2条带逐步变淡，比较明显的效应剂量是从1 mg/ml起

2.2 对HUVEC细胞增殖生长的抑制作用

F0001可显著抑制VEGF刺激的HUVEC细胞增殖，其IC50为123 ng/ml，与安维汀（IC50 = 122 ng/ml）相当（图2）。

2.3 对裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用

F0001或安维汀对裸小鼠皮下移植瘤的抑瘤效果见表2。

1） F0001 0.5/1.5/5 mg/kg可明显抑制人结肠癌Ls- 174t裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率分别为40%、47%和68%；安维汀 1.5/5 mg/kg对Ls-174t的抑瘤率分别为46%和63%。荷瘤小鼠对两药物均能很好耐受，没有体重下降等症状发生。总体比较，二者对Ls-174t裸小鼠皮下移植瘤疗效相当。

2） CPT-11 6 mg/kg对Ls-174t的抑瘤率为60%；F0001或安维汀与CPT-11合用，疗效显著增强，抑瘤率分别从单药的69%和68%提高到89%和89%。CPT-11单用使荷瘤小鼠体重下降，但与F0001或安维汀合用小鼠状态有所改善，体重回升。总体比较，无论是单用还是与CPT-11合用，F0001和安维汀对结肠癌Ls-174t的疗效相当。

3） F0001 0.5/1.5/5 mg/kg可明显抑制人肺癌NCI-H460裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率分别为53%、62%和68%；安維汀 1.5/5 mg/kg对NCI-H460的抑瘤率分别为57%和61%。荷瘤小鼠对两药物均能很好耐受，没有体重下降等症状发生。总体比较，二者对NCI-H460裸小鼠皮下移植瘤疗效相当。

4） F0001 1.5/5 mg/kg可明显抑制人恶性胶质瘤U-87MG裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率分别为74%和86%；安维汀 1.5/5 mg/kg对U-87MG的抑瘤率分别为64%和83%。荷瘤小鼠对两药物均能很好耐受，没有体重下降等症状发生。总体比较，二者对U-87MG裸小鼠皮下移植瘤疗效相当。

2.4 对裸小鼠的代谢动力学

人结肠癌Ls-174t荷瘤裸小鼠单次静脉注射F0001或安维汀 1.5/5.0 mg/kg后，血清药物峰浓度时间Tmax均相同；同等剂量下，血清药物浓度C0值和血清药物暴露水平AUC0-t都比较接近，提示F0001与安维汀在荷瘤鼠中的血清药代过程相似。

在肿瘤组织中，F0001或安维汀 5.0 mg/kg单次注射后的达峰时间Tmax、峰浓度Cmax、药物暴露水平AUC0-t都比较一致。总体结果提示，二者在荷瘤裸小鼠体内的代谢动力学（PK/PD）过程相似。

3 讨论

早期我们从体外作用机制及活性、体内对裸小鼠荷人结肠癌Ls-174t（包括单药及与化疗药合用）、肺癌NCI-H460、恶性胶质瘤U-87MG的抑瘤活性等方面研究了F0001的临床前主要药效学，随着我国《生物类似药研发与评价技术指导原则（试行）》的出台[11]，我们结合本品药代动力学（PK）试验（另行试验研究）补充进行了本品在荷瘤裸小鼠的体内代谢动力学（PK/PD）的试验研究。

试验中由于试剂、耗材、及96孔板细胞复孔的均一性等原因，部分单孔OD值数据出现反跳现象，但不影响F0001随浓度增加对VEGF的抑制作用。后续本品生产中活性检测的质控将得到优化。

F0001与安维汀在荷人结肠癌Ls-174t裸小鼠中的血清药代过程相似，高剂量（5.0 mg/kg）时二者在肿瘤组织中的暴露水平也一致。但是，在低剂量（1.5 mg/kg）时二者在肿瘤组织中的暴露水平有差异，AUC0-t分别为4.24和13.71 h·mg/ml，分析其原因主要是受试品在肿瘤组织中48 h后的浓度已均低于定量下限。

总体而言，F0001与安维汀体外作用机制及活性相当、体内抑瘤效果相当，二者在人结肠癌Ls-174t荷瘤小鼠体内PK/PD参数相似；F0001与原研药安维汀在主要药效学方面高度类似。

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