培美曲塞与厄洛替尼联合或序贯治疗对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

张小华　陈开杰　张海伟　刘　静　贾毅敏

(重庆市肿瘤研究所药学部,重庆　400030)



培美曲塞与厄洛替尼联合或序贯治疗对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

张小华陈开杰张海伟1刘静贾毅敏

(重庆市肿瘤研究所药学部,重庆400030)

摘要〔〕目的探讨培美曲塞与厄洛替尼联合或序贯对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。方法以人肺腺癌 A549 细胞为研究对象，分别应用培美曲塞与厄洛替尼单药、联合及不同序贯方法干预72 h后，MTT法检测细胞增殖及抑制情况，并计算联合指数(CI)，流式细胞仪(FCM)检测细胞周期及凋亡情况，蛋白质印迹法(Western印迹法)检测磷酸化表皮生长因子受体(p-EGFR)及磷酸化-ATK(p-AKT)的表达情况。结果培美曲塞序贯厄洛替尼组(P-E)对A549细胞增殖的抑制率及凋亡率较高，明显高于培美曲塞(P)和厄洛替尼(E)单药组以及厄洛替尼联合(E+P)或序贯培美曲塞组(E-P)(P均<0.05)。E组和E+P/E-P组的G1期细胞所占比例较对照组明显增多(P<0.05)，P组和P-E组的S期细胞所占比例较对照组明显增多(P均<0.05)。各药物干预组细胞凋亡率均较对照组明显增高，且P-E组细胞凋亡率明显高于其他组(P均<0.05)。P-E组A549细胞p-AKT及p-EGFR的表达水平均明显低于对照组(P均<0.05)。结论培美曲塞可有效抑制肺腺癌A549细胞的增殖作用，且与厄洛替尼序贯应用的协同效果更为明显，其作用机制可能与p-EGFR及p-AKT信号通路相关。

关键词〔〕肺腺癌；培美曲塞；厄洛替尼；序贯；联合

1重庆市肿瘤研究所肿瘤实验室

第一作者：张小华(1966-)，女，副主任药师，主要从事临床药理学方面的研究。

肺癌具有起病隐匿的特点，绝大多数患者临床确诊时已经处于晚期，失去最佳治疗时期〔1〕。化疗和表皮生长因子受体(EGFR)已经成为治疗肺癌的主要方法，培美曲塞是一种新的化疗药物，属于第3代化疗药物，可以抑制胸腺酸合成酶、甘氨酰胺核苷酸转甲酰酶以及二氢叶酸还原酶来拮抗叶酸的代谢，进而使核苷酸合成受到抑制，最终起到抑制肿瘤生长的作用。厄洛替尼能抑制酪氨酸激酶，阻断信息的转导起到抑制肿瘤的作用〔2〕。培美曲塞与厄洛替尼联合或序贯在临床上被广泛应用于治疗肺癌，并取得较好的临床疗效。本研究旨在分析培美曲塞与厄洛替尼联合或序贯治疗对肺腺癌细胞株A549细胞增殖和凋亡的影响。

1材料与方法

1.1细胞野生型K-ras基因及EGFR基因突变的肺腺癌A549细胞株均来自我院，应用RPMI1640培养液进行培养，应用胰蛋白酶进行消化传代，取对数增长期的细胞应用于实验。

1.2实验试剂及药品RPMI1640培养液与胎牛血清均由美国Hyclone公司提供；青霉素、链霉素均由山东齐鲁制药有限公司提供；厄洛替尼由美国罗氏制药有限公司提供，以二甲基亚砜(DMSO)溶解，应用培养液将其稀释到所用浓度；培美曲塞由齐鲁制药有限公司提供，以生理盐水溶解，应用培养液将其稀释到所用的浓度；MTT以及DMSO均由美国Sigma公司提供；Hoechst 33258染色剂、细胞凋亡以及细胞周期检测试剂均由上海生物技术有限公司提供。

1.3方法

1.3.1分组所有细胞平均分为培美曲塞单药组(P)、厄洛替尼单药组(E)、厄洛替尼联合培美曲塞组(E+P)、厄洛替尼序贯培美曲塞组(E-P)、培美曲塞序贯厄洛替尼组(P-E)以及非药物干预的对照组。

1.3.2指标检测①应用MTT法检测培美曲塞与厄洛替尼对A549细胞增殖的影响。将对数增长期的细胞接种于96孔板上，待细胞贴壁开始生长以后将不同浓度的培美曲塞和厄洛替尼加入到孔中，每个浓度均设置6个重复的孔，将仅仅含有培养液、细胞以及相应浓度的DMSO孔设置为对照组，培养细胞72 h以后将MTT液加入到孔中，培养细胞4 h以后将上清液丢弃掉，加入DMSO震荡以后应用自动酶联免疫检测仪检测570 nm波长的各个孔吸光度(D)，并且计算细胞增殖抑制情况。联合指数(CI)测定：应用Compusyn软件计算CI值，CI值>1表示厄洛替尼和培美曲塞有拮抗作用，CI=1表示厄洛替尼和培美曲塞具有相加作用，CI值<1表示厄洛替尼和培美曲塞具有协同作用。倒置相差显微镜下观察A549细胞被厄洛替尼和培美曲塞作用以后的形态。②流式细胞仪(FCM)检测厄洛替尼和培美曲塞作用以后细胞的凋亡情况及细胞周期分布水平。③蛋白质印迹(Western印迹)法检测厄洛替尼和培美曲塞作用以后A549细胞磷酸化EGFR(p-EGFR)及磷酸化-ATK(p-AKT)的表达情况。

1.4统计学方法应用SPSS17.0软件进行F检验、SNK法检验。

2结果

2.1各组肺腺癌A549细胞MTT检测结果比较各药物干预组细胞增殖抑制率均明显高于对照组〔(3.42±0.34)%〕(P>0.05)，P组〔(48.73±3.92)%〕与E+P组〔(54.34±6.39)%〕细胞增殖抑制率比较无统计学意义(P>0.05)；P-E组〔(66.53±6.42)%〕细胞增殖抑制率明显高于P组、E+P组及E-P组〔(23.84±5.27)%〕，各干预组中E-P组细胞增殖抑制率最低，E组为(38.58±4.32)%(P均<0.05)。各干预组中CI值比较，P-E组CI值最低，为(0.37±0.03)；而E-P最高，为(1.97±0.21)；对照组为2.07±0.09，P组为1.07±0.06，E组为1.24±0.04，E+P组为1.15±0.06。

2.2各组肺腺癌A549细胞分布比例及凋亡情况比较E组、E+P组及E-P组的G1期细胞比例较对照组增高，且P组和P-E组的S期细胞比例较对照组增多(P<0.05)；G2期细胞所占比例在各药物干预组均较对照组明显减少(P<0.05)；各药物干预组细胞凋亡率均较对照组明显增高(P<0.05)。P组、E+P组与E-P组细胞凋亡率比较差异显著(P<0.05)，而P-E组细胞凋亡率明显高于其他组(P<0.05)。见表1。

组别细胞周期G1SG2凋亡率对照组53.1±5.235.0±4.514.0±2.90.9±0.1P组38.5±4.155.7±3.11)3.7±0.51)27.9±2.31)2)3)E组76.9±8.91)17.8±2.04.9±0.71)8.0±1.11)2)3)E+P组63.9±3.21)33.5±1.73.3±0.51)30.8±1.51)2)3)P-E组39.0±2.958.7±5.41)1.2±0.11)43.1±3.41)E-P组80.2±9.81)19.2±1.90.7±0.11)19.8±2.31)2)

与对照组比较：1)P<0.05；与P-E组比较：2)P<0.05；与E-P组比较：3)P<0.05

2.3各组A549 细胞中p-AKT和 p-EGFR 的表达比较E组(0.25±0.05)及P-E组(0.17±0.04)A549 细胞中p-AKT的表达水平较对照组(0.62±0.08)明显下降，且P-E组明显低于E组，而P组(1.01±0.09)较对照组明显上调，E+P组(0.70±0.06)和E-P组(0.53±0.06)p-AKT 表达水平较E组及P-E组明显上升(P均<0.05)。另外，P组及E-P组细胞p-EGFR的表达水平(1.67±0.07，1.70±0.06)较对照组(1.19±0.05)明显上调，而P-E组(0.78±0.05)较对照组明显下调，且E-P组细胞p-EGFR的表达水平较E组(1.16±0.04)及E+P组(1.05±0.06)明显上调，而P-E组较E组及E+P组明显下调(均P<0.05)。

3讨论

研究发现〔3〕，K-ras的突变与恶性肿瘤的发生以及发展具有较大关系，该基因属于ras家族中的成员，在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，大约有20%～30%的患者存在K-ras基因突变，其中肺腺癌占大多数。且研究证实〔4〕，K-ras是引起NSCLC对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)产生耐药的重要因素。厄洛替尼是一种口服的EGFR-TKIs药物，在临床中已广泛应用于EGFR基因突变的肺癌患者，但不能使K-ras基因突变的肺癌患者从中获益〔5〕。培美曲塞是新一代多靶点细胞毒药物，可通过有效抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶等的活性对叶酸代谢起到干扰作用，从而降低DNA、RNA等的合成，起到阻断肿瘤细胞增殖的作用。但有研究显示，培美曲塞不能显著改善肺癌患者的治疗有效率，其与其他化疗药物的联合应用疗效不一〔6〕。本研究提示培美曲塞及厄洛替尼对肺腺癌A549细胞的增殖均有较好的抑制作用，且培美曲塞序贯厄洛替尼对A549细胞的增殖抑制作用具有协同效果，但是厄洛替尼序贯培美曲塞对A549细胞增殖的抑制作用具有拮抗效果。分析本研究结果原因，抗肿瘤药物的各种作用机制存在一定差异，培美曲塞与厄洛替尼抑制肺腺癌细胞的作用周期也存在差异，厄洛替尼主要应用于细胞分裂的G1期，培美曲塞则会作用在S期，当厄洛替尼序贯培美曲塞的时候，会使肺腺癌细胞被阻滞在G1期，致使S期的细胞显著减少，进而使两者的效果具有拮抗作用，使对细胞的抑制作用降低〔7〕。厄洛替尼联合培美曲塞的时候，G1期的肺腺癌细胞会显著增多，但是处于S期的细胞不会明显减少，进而说明培美曲塞的作用没受到抑制作用，说明两种药物联合对细胞增殖和凋亡抑制作用没有显著增加的原因为对细胞周期作用不同。而应用培美曲塞序贯厄洛替尼能使G1期的细胞数量显著减少，S期细胞的数目显著增加，会使肺腺癌细胞被阻滞于S期后迅速诱导其进入凋亡阶段，进而使两种药物作用产生协同效果〔8〕。FCM 法检测各组细胞凋亡率的结果与其他研究〔9〕结果具有一致性，充分证实培美曲塞序贯厄洛替尼对肺腺癌A549细胞具有较强的抑制作用。且研究还发现，培美曲塞序贯厄洛替尼对肺腺癌A549细胞具有抑制作用与p-AKT的激活有关，该物质被激活能有效增强细胞对厄洛替尼的敏感性〔10〕。

综上所述，应用培美曲塞序贯厄洛替尼能有效抑制肺腺癌A549细胞的增殖和凋亡，有效提高肺腺癌患者的治疗效果，值得临床推广。

参考文献4

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7贾刚.吉非替尼与培美曲塞对人肺腺癌细胞SPC-A1生长及细胞周期的作用〔J〕.现代肿瘤医学,2014;22(4):790-4.

8顾红芳,许春明,王向前,等.厄洛替尼联合全脑放疗治疗肺腺癌伴脑转移的临床观察〔J〕.临床肿瘤学杂志,2014;19(12):1118-22.

9边劲,王琳,寻琛,等.阿法替尼和吉非替尼分别联合培美曲塞对人肺腺癌细胞作用的研究〔J〕.安徽医科大学学报,2014;49(6):772-6.

10黄伟,王琳,寻琛,等.吉非替尼与培美曲塞联合时序对EGFR不同类型人肺腺癌细胞作用观察〔J〕.中华肿瘤防治杂志,2014;21(5):346-51.

〔2014-11-10修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者：陈开杰(1977-)，男，副主任药师，主要从事临床药学方面的研究。

基金项目：重庆市医学科研计划项目(No.2013-2-129)

中图分类号〔〕R73〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6658-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.007