四君子丸对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织细胞caspase-3表达的影响

丛培玮　王艳杰　赵丹玉　郭隽馥

(辽宁中医药大学教学实验中心生物技术实验室，辽宁　沈阳　110847)



四君子丸对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织细胞caspase-3表达的影响

丛培玮王艳杰1赵丹玉1郭隽馥

(辽宁中医药大学教学实验中心生物技术实验室，辽宁沈阳110847)

摘要〔〕目的探讨四君子丸对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织细胞凋亡相关蛋白caspase-3表达的影响。方法在小鼠右侧腋窝皮下，接种浓度为1×107个/ml的小鼠肺癌Lewis细胞悬液0.1 ml，模型建立成功后将小鼠分为Lewis肺癌组、中药治疗组(成瘤后灌胃四君子丸0.093 6 g/10 g，1次/d，连续14 d)、顺铂组(腹腔注射0.05 mg/10 g，1次/w，持续2次)。采用透射电镜观察各组肿瘤组织细胞形态学变化，采用Real-time PCR和免疫组化测定肿瘤组织caspase-3 mRNA及蛋白的表达水平。结果透射电镜结果显示：Lewis肺癌组细胞镜下呈现出明显恶性肿瘤细胞特征；中药治疗组镜下可见肿瘤细胞以凋亡变化为主，大量凋亡细胞、凋亡小体及坏死细胞；顺铂组镜下可见坏死细胞和典型凋亡细胞及凋亡小体。Real-time PCR及免疫组化结果共同显示：和Lewis肺癌组比较，中药治疗组和顺铂组caspase-3 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。结论四君子丸能够显著提高Lewis肺癌小鼠模型肿瘤组织中caspase-3的表达，从而促进肿瘤细胞凋亡。

关键词〔〕四君子丸；肺癌；凋亡；caspase-3

1辽宁中医药大学基础医学院生物化学教研室

第一作者：丛培玮(1981-)，女，博士，主要从事中医药对呼吸系统疾病防治的基础研究。

研究发现〔1，2〕，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)家族在多种肿瘤细胞的凋亡过程中表达下调，与肿瘤的发生、发展、转移有着密切的关系。caspase-3是caspase 家族中最重要的凋亡执行者，负责全部或部分关键性蛋白的酶切，使胞质、胞核及细胞骨架的重要蛋白酶失活，从而引发细胞凋亡。近期研究表明〔3〕，很多药物可以通过调节caspase家族中caspase-3的蛋白表达调节细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤生长的作用。本研究依据中医培土生金原理，运用健脾益气的四君子丸为干预措施，利用Lewis肺癌小鼠模型，观察四君子丸对肿瘤组织中caspase-3基因和蛋白表达的影响。

1材料和方法

1.1实验动物SPF级C57雄性小鼠32只，由常州卡文斯实验动物有限公司提供〔生产许可证：SCXK(苏)2011-0003；合格证编号：0024590，实验动物使用许可证：SYXK(苏)2012-010〕，日龄21～35 d；体重18～22 g。

1.2主要试剂和仪器四君子丸(湖北广仁药业有限公司，批号：120401)，顺铂(齐鲁制药有限公司，批号：1W2A1301004B)；TUNEL原位凋亡检测试剂盒，RNAiso Plus 试剂盒，Real-time PCR试剂盒，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(Takara公司)多聚赖氨酸溶液，Triton-X100(南京凯基生物科技发展有限公司)；二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，福州迈新生物科技有限公司)；苏木素染色液(南京建成生物工程研究所)；中性树胶、二甲苯、甲醇、乙醇(中国国药集团化学试剂有限公司)。THZ-312台式恒温振荡器(上海精宏实验设备有限公司)；101AS-3电热鼓风干燥箱(上海圣欣科学仪器有限公司)；JEM-100CXⅡ型透射电镜(日本日立公司)。

1.3模型制备与评价收集体外培养的小鼠肺癌Lewis细胞，计数，调整细胞悬液浓度为1×107个/ml，接种0.1 ml细胞悬液于小鼠右侧腋窝皮下；待成瘤后用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至50 mm3，视为模型建立成功。

1.4实验动物分组和给药模型建立成功后随机分为Lewis肺癌组、中药治疗组、顺铂组，每组8只。同时开始给药，给药14 d后处死小鼠。四君子丸粉碎成粉末，利用蒸馏水配制成0.468 g/ml，中药治疗组：成瘤后灌胃四君子丸0.093 6 g/10 g，1次/d，连续14 d；顺铂组：腹腔注射0.05 mg/10 g，1次/w，持续2次。

1.5肿瘤重量的测定和肿瘤生长抑制率的计算给药14 d后处死小鼠，手术剥取瘤块称重。计算抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率(%)，公式为(给药组平均瘤重-模型对照组平均瘤重)/模型对照组平均瘤重×100%。

1.6采用透射电镜观察肿瘤生长完整剥离瘤体，取材、固定、脱水、环氧树脂Epon812浸透过夜，包埋，40℃、60℃各24 h常规聚合，LKB V超薄切片机切片，醋酸铀、柠檬酸铅双染色，JEM-100CXⅡ型透射电镜下观察。

1.7采用Real-time PCR测定肿瘤组织caspase-3 mRNA表达水平给药14 d后取肿瘤组织，RNAiso Plus 试剂盒提取组织细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度：A260/A280 1.8～2.2。去除基因组DNA，反转录RT反应和SYBR GreenⅠ法相对定量分析。反转录条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。实时定量PCR反应条件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，32个循环。caspase-3基因：上游引物5′-TGGACCTGTTGACCTGAAAA-3′，下游引物5′-ACAAAGCGACTGGATGAACC-3′；内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因：上游引物5′-GAGGACCAGGTTGTCTCCTG-3′，下游引物5′-GGATGGAATTGTGAGGGAGA-3′，引物由大连宝生物工程公司设计并合成。

1.8采用免疫组化测定肿瘤组织caspase-3蛋白表达水平溶液灭活酶室温(15℃～25℃)封闭10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗。滴加即用型山羊血清50～100 μl 封闭，室温孵育20 min。滴加一抗50～100 μl，37℃，湿盒孵育2 h，PBS浸洗。滴加增强剂50 μl，室温湿盒孵育30 min。滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体50 μl，37℃，孵育30 min。PBS浸洗3次。每张片子加2滴新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)溶液显色。镜下观察染色深浅，染好立即终止，自来水轻柔冲洗15 min，用蒸馏水终止显色反应。复染10 min，用蒸馏水冲洗干净，自来水冲洗后返蓝。脱水封片。光学显微镜下观察组织细胞中蛋白的表达情况，取3个高表达区域拍照保存。

1.9统计学方法应用SPSS18.0软件，数据组间比较采用单因素方差分析，采用双变量简单分析法测定变量间的相关性。

2结果

2.1四君子丸对Lewis肺癌小鼠肿瘤重量和抑瘤率的影响与Lewis肺癌组〔(3.52±0.65)g〕比较，中药治疗组〔(2.07±0.43)g〕和顺铂组〔(2.09±0.35)g〕肿瘤重量显著降低(P<0.01)，中药治疗组抑瘤率达到41.15%，顺铂组抑瘤率达到40.65%。

2.2四君子丸对Lewis肺癌小鼠肿瘤形态学的影响电镜结果显示：Lewis肺癌组细胞呈现出恶性肿瘤细胞特征，生长旺盛，肿瘤细胞大小不一，细胞核大、深染，核浆比例失调，核异形性明显，细胞膜完整，胞质内线粒体肿胀明显，偶见粗面内质网，散在核糖体颗粒，可见巨核细胞。中药治疗组：镜下可见肿瘤细胞以凋亡变化为主，有的呈现出细胞凋亡早期的特点，肿瘤细胞大小不一，细胞体积明显缩小，核膜稍扩张，核形不规整，核内异染色质增多、边集，浓缩成团块状或新月状，分布在核膜的内侧，而细胞膜结构完整，还有部分细胞固缩核裂解，形成许多细胞小体，即凋亡小体，由膜包绕，小体内可见核的残片及胞质。顺铂组：镜下可见坏死细胞和典型凋亡细胞及凋亡小体，坏死细胞体积异常增大，核大畸变，细胞大小不一，较多的凋亡细胞，可见少量坏死及炎细胞浸润。见图1。

图1　四君子丸对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织细胞超微结构的影响(×200)

2.3四君子丸对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织细胞caspase-3 mRNA表达的影响与Lewis肺癌组(0.73±0.17)比较，中药治疗组(1.24±0.27)和顺铂组(1.31±0.24)caspase-3 mRNA表达水平显著增加(P<0.01)。

2.4四君子丸对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织细胞caspase-3蛋白表达的影响免疫组化结果显示，肿瘤组织中caspase-3阳性细胞为棕色。与Lewis肺癌组(4 603.17±244.03)比较，中药治疗组(13 203.93±113.72)和顺铂组(14 870.60±653.00)caspase-3阳性细胞显著增多，平均光密度值显著增加(P<0.01)。见图2。

图2　四君子丸对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织细胞caspase-3蛋白表达的影响(×40)

3讨论

目前，国内外针对肿瘤防治机制的研究〔4〕主要集中在三大领域：免疫抑制、抗凋亡及耐药。细胞凋亡被称为程序性细胞死亡，正常细胞凋亡受阻，细胞增殖与凋亡的平衡调节被破坏，细胞凋亡率下降。一旦机体不能重新恢复这种平衡，细胞数目将不断增加，表现出生长优势，而这种恶性细胞无限增殖是肿瘤发生的重要机制之一〔5〕。研究表明细胞凋亡的途径主要有三种〔6〕：第一种是线粒体途径，第二种是死亡受体途径，第三种是通过凋亡诱导因子实现凋亡。前两条凋亡通路均需通过 caspase通路完成。caspase-3是caspase通路中最重要的蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路〔7〕。赵阳等〔8〕发现，在肺癌组织中存在凋亡下调的变化，caspase-3可能在肺癌的发生发展中发挥重要的作用。郭文峰〔9〕发现，与正常肺组织比较，caspase-3蛋白、基因表达水平在非小细胞肺癌组织中显著上调，观察caspase-3表达有助于临床正确制订初始化疗方案和判断预后。Sikdar等〔10〕发现CGS可能通过激活caspase-3的表达促进细胞凋亡、坏死。Jiang等〔11〕发现与正常肺组织比较，caspase-3蛋白的表达在非小细胞肺癌裸鼠肺组织中显著上调，caspase-3表达与肿瘤的恶性程度呈正相关。

无论中药新药作为单独治疗用药还是联合现代常规治疗，或是化疗、放疗、靶向等现代常规治疗后的中药维持治疗，其临床定位都是要发挥其临床价值。中医认为脾虚气血生化乏源、气血运行不畅，气虚血滞，壅阻经络脏腑，遂可结成肿瘤。脾胃为土，肺为金，土生金，脾虚及肺，虚则补其母。现代研究〔12〕发现，四君子丸(宋·《太平惠民和剂局方》)运用中医培土生金原理即补脾益肺法可显著改善肺癌恶病质诸多症状。方中人参性甘大补脾胃之气，为君药；白术苦温，助君药燥湿健脾，为臣药；茯苓甘淡，渗湿利尿，为佐药；炙甘草甘平，和中益气，为使药。四药相辅，具有益气健脾补肺之功效。本实验结果显示：中药治疗组可显著增加caspase-3 mRNA和蛋白的表达，从而诱导细胞凋亡。 顺铂是一种类烷化剂的金属铂类化合物，也是广泛用于肺癌化学治疗的一线药物，其作用机制通常认为是通过与癌细胞的DNA结合形成交叉链，从而破坏DNA的功能，阻止DNA的复制。另据文献〔13〕报道，顺铂可以通过细胞特异性caspase-3依赖的信号途径诱导凋亡的发生，从而发挥杀瘤效应。

化疗是肺癌综合治疗的重要手段之一，但由于肺癌细胞内在的和(或)获得性多药抗药性(MDR)的形成，使抗癌药物对其化疗的疗效下降，往往导致化疗失败。有研究〔3〕表明，凋亡受阻是肿瘤细胞的另一生物学特性，多种药物耐药均与凋亡作用抑制有关。抵抗抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡可能是肺癌细胞MDR的本质之一。顺铂作为肺癌的一线化疗药物，其疗效呈明显剂量依赖性，但严重的肾毒性限制了剂量的增加，且易产生耐药。由于顺铂耐药的存在造成肺癌患者5 年生存率的降低。因此在最大限度发挥化疗的疗效，并尽量降低其毒性，同时逆转肺癌对顺铂的耐药是当前研究的热点。有研究〔15〕表明，一些中药的有效成分具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，中西医结合能有效治疗恶性肿瘤，同时能减轻放化疗的不良反应。

参考文献4

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6Fiandalo MV，Kyprianou N.Caspase control：protagonists of cancer cell apoptosis〔J〕.Exp Oncol，2012；34(3)：165-75.

7Nguyen QD，Challapalli A，Smith G，etal.Imaging apoptosis with position emission tomography：′bench to bedside′ development of the caspase-3/7 specific radiotracer〔(18)F〕ICMT-11〔J〕.Eur J Cancer，2012；48(4)：432-40.

8赵阳，李晓军，隋昕，等.PCNA和Caspase-3在肺癌组织中的表达及意义〔J〕.细胞与分子免疫学杂志，2010；26(2)：154-6.

9郭文峰.Caspase-3 GSTPgp在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义〔J〕.临床肺科杂志，2010；15(4)：503-5.

10Sikdar S，Mukherjee A，Ghosh S，etal.Condurango glycoside-rich components stimulate DNA damage-induced cell cycle arrest and ROS-mediated caspase-3 dependent apoptosis through inhibition of cell-proliferation in lung cancer，in vitro and in vivo〔J〕.Environ Toxicol Pharmacol,2014；37(1)：300-14.

11Jiang H，Zhao PJ，Su D，etal.Paris saponin I induces apoptosis via increasing the Bax/Bcl-2 ratio and caspase-3 expression in gefitinib-resistant non-small cell lung cancer in vitro and in vivo〔J〕.Mol Med Rep,2014；9(6)：2265-72.

12吕苑.四君子汤的药理研究和临床应用〔J〕.中医研究，2012；25(1)：76-8.

13Qin S，Yang C，Wang X，etal.Overexpression of Smac promotes cisplatin-induced apoptosis by activating caspase-3 and caspase-9 in lung cancer A549 cells〔J〕.Cancer Biother Radiopharm，2013；28(2)：177-82.

14Basu S，Ganguly A，Chakraborty P，etal.Targeting the mitochondrial pathway to induce apoptosis/necrosis through ROS by a newly developed Schiff′s base to overcome MDR in cancer〔J〕.J Biochim，2012；94(1)：166-83.

〔2014-12-19修回〕

(编辑袁左鸣)

Effects of sijunzi bolus on expression of caspase-3 in tumor cell of Lewis lung cancer mice

CONG Pei-Wei，WANG Yan-Jie，ZHAO Dan-Yu，etal.

Biotechnology Laboratory，Teaching and Experiment Center，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of sijunzi bolus on the expression of caspase-3 of the Lewis lung carcinoma mice.MethodsTo vaccinate the 1×107/ml suspension liquid of Lewis lung carcinoma on the right side of mice axillary, then the successful models were divided into Lewis lung cancer, Chinese medicine treatment(sijunzi pill 0.093 6 g/10 g, once a day, 14 d),cisplatin group(0.05 mg/g,once a week, 2 times).To observe the morphology of apoptosis cell by transmission electron microscope, and the capacity of caspase-3 mRNA and protein levels were tested by real-time PCR and immunohistochemical respectively.ResultsLewis lung cancer groups presented the characteristics of malignant tumor cells. Apoptosis cells,apoptotic bodies, death cells were expressed significantly in Chinese medicine treatment group and the similar situation were seen in cisplatin group. The expression level of caspase 3 were significantly increased at both mRNA and protein compared with those of Lewis lung cancer group(P<0.01).ConclusionsSijunzi bolus might effectively increase the caspase 3 expression of the tumor tissue, thereby promote tumor cells apoptosis.

【Key words】Sijunzi bolus； Lung cancer；Apoptosis；caspase-3

通讯作者：王艳杰(1976-)，女，副教授，主要从事中医药对呼吸系统疾病防治的基础研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81202789)；辽宁省教育厅高等学校科研资助项目(No.2009A500)；辽宁省博士启动基金资助项目(No.20111134)

中图分类号〔〕R273〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6644-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.002