疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞TLR4/p38MAPK信号通路的影响

李媛媛　杨钦河　张金文　龚享文　王观龙　梁荫基　张玉佩　王　洪　金　玲　何毅芳　邓远军　林春梅

(暨南大学医学院，广东　广州　510632)



疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞TLR4/p38MAPK信号通路的影响

李媛媛杨钦河张金文龚享文王观龙梁荫基张玉佩王洪金玲1何毅芳邓远军林春梅

(暨南大学医学院，广东广州510632)

摘要〔〕目的探讨疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠肝细胞TLR4/p38MAPK信号通路的干预作用，从炎症角度揭示疏肝健脾方药抗大鼠NASH的作用机制。方法选用SPF级SD大鼠120只，随机分为8组。采用高脂饲料喂养建立大鼠NASH 模型，26 w后对肝组织进行HE染色，油红O染色，全自动生化分析肝功血脂改变，ELISA检测血清白介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量；采用离体循环灌注Ⅳ型胶原酶法分离肝细胞，流式细胞术(FCM)对肝细胞纯度进行活性和纯度鉴定。荧光定量PCR检测肝细胞TLR4、p38MAPK mRNA表达量；Western印迹法检测肝细胞蛋白TLR4、p38MAPK及磷酸化蛋白p38MAPK表达水平。结果26 w高脂饮食成功建立了NASH大鼠模型，HE染色和油红O染色证实大鼠模型存在典型的NASH病理改变。与正常组比较，模型组血清IL-1、IL-6、 TNF-α含量显著升高(P<0.01)；各用药组与模型组比较，合方高、低剂量组IL-1、IL-6、 TNF-α含量显著降低(P<0.05，P<0.01)，健脾高剂量组IL-1、IL-6含量降低有统计学差异(P<0.05)。与正常组比较，模型组大鼠肝细胞TLR4、p38MAPK mRNA表达及磷酸化蛋白p38MAPK表达量显著增加(P<0.01)；各用药组与模型组比较，合方高、低剂量组，健脾高剂量组TLR4、p38MAPK mRNA蛋白及磷酸化蛋白p38MAPK表达量显著降低(P<0.05，P<0.01)。结论疏肝健脾方药能够降低NASH大鼠血清炎症因子水平，改善NASH大鼠肝脏的病理变化，TLR4/p38MAPK可能是疏肝健脾方药发挥抗NASH作用的药物靶点。

关键词〔〕疏肝健脾方药；NASH；肝细胞；TLR4/p38MAPK信号通路

1暨南大学附属第一医院中医科

第一作者：李媛媛(1990-)，女，硕士，主要从事中西医结合肝病研究。

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是非酒精性脂肪性肝病向肝纤维化、肝硬化甚至肝癌发生发展的一个重要病理环节〔1〕，研究NASH大鼠肝细胞与炎症反应相关基因的相互关系已成为NASH发病机制的研究热点〔2～4〕。研究表明，TLR4/p38MAPK与脂肪肝的发生发展密切相关〔5,6〕，但其详细机制未明。本研究拟观察疏肝健脾方药对NASH大鼠肝细胞TLR4/p38MAPK通路的影响，从炎症角度探讨该方药抗NASH的作用机制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物120只SPF级雄性SD大鼠，体重(200±20)g,购自广州中医药大学实验动物管理中心(批号：No.0107792)，许可证号：SCXK(粤)2008-0020。动物饲养于暨南大学实验动物管理中心〔许可证号：SYXK(粤)2012-0117〕。

1.1.2主要试剂胎牛血清(美国Hyclone公司)；Ⅳ型胶原酶(美国Life Technologies公司)；大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1 和IL-6 ELISA试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)；抗p38MAPK、抗p-p38MAPK、抗-TLR4一抗(美国Cell Signaling Technology公司)；SYBR Premix Ex Taq PCR试剂盒(日本Takara公司)。

1.1.3实验药物(1)疏肝方：柴胡疏肝散(柴胡6 g，芍药5 g，香附5 g，枳壳5 g，陈皮6 g，川芎5 g，炙甘草3 g)；(2)健脾方：参苓白术散(人参15 g，茯苓15 g，白术15 g，薏苡仁9 g，白扁豆12 g，砂仁6 g，山药15 g，桔梗6 g，莲子9 g，炙甘草9 g)；(3)综合方：柴胡舒肝散与参苓白术散的合方。

方剂组成、剂量均参照《方剂学》教材〔7〕。给药剂量按人和动物体表面积折算，方药低剂量组相当于人类临床等效剂量，高剂量组相当于3倍人类临床等效剂量。中药为深圳华润三九医药股份有限公司中药配方颗粒剂，均购于暨南大学附属第一医院中药房。

1.2方法

1.2.1实验分组及用药120只大鼠，适应性饲养1 w后，根据体重随机分为8组，每组15只，其中9只检测常规指标，6只提取肝细胞，分别为正常组、模型组、疏肝高/低剂量组、健脾高/低剂量组、合方高/低剂量组。除正常组大鼠给予基础饲料喂养外，其余各组均以高脂饲料喂养，连续26 w。在造模的同时，正常组及模型组按10 ml/kg BW量给予蒸馏水灌胃干预，用药组给予相应药物灌胃干预：疏肝高剂量组(灌服疏肝方9.6 g·kg-1·d-1)、疏肝低剂量组(灌服疏肝方3.2 g·kg-1·d-1)、健脾高剂量组(灌服健脾方30.0 g·kg-1·d-1)、健脾低剂量组(灌服健脾方10.0 g·kg-1·d-1)、综合方高剂量组(灌服疏肝健脾合方39.6 g·kg-1·d-1)、综合方低剂量组(灌服疏肝健脾合方13.2 g·kg-1·d-1)。由于灌胃操作不当，健脾高剂量组与合方高剂量组各死亡1只大鼠。

1.2.2指标检测及方法

1.2.2.1肝组织病理学观察模型建立成功后，每组取9只，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，采集肝组织，行HE染色与油红O染色观察肝组织病理变化。

1.2.2.2血脂、细胞因子检测适量肝组织匀浆取上清，用全自动生化分析仪检测肝组织高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量，ELISA检测血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量。

1.2.2.3肝细胞的分离与鉴定

1.2.2.3.1肝细胞的分离与制备在前期细胞分离与鉴定的基础上加以改进〔8〕,各组大鼠以3%的戊巴比妥钠(1 ml/kg BW)腹腔麻醉，呈U形切口切开腹部，暴露肝脏，游离肝门静脉及下腔静脉，并结扎固定。采用离体循环灌注Ⅳ型胶原酶，差速离心、密度梯度离心和选择性贴壁分离肝细胞。

1.2.2.3.2肝细胞的纯化与鉴定 收集未纯化的肝细胞，在沉淀中加入10%胎牛血清1640培养基，垂悬后以混悬液∶Typan blue=9∶1比例染色，计数肝细胞，以4×106个/ml接种于培养瓶中培养12 h后，90%以上的肝细胞贴壁，PBS洗掉未贴壁的细胞，得到纯化的肝细胞。经胰蛋白酶消化后以PBS吹打后离心去上清获得肝细胞，加入固定剂15 min，添加破膜试剂，加入一抗兔抗大鼠抗CK18；室温孵育30 min，加二抗羊抗兔IgG-FITC， 30 min后，再加破膜试剂洗涤2次，流式细胞仪鉴定肝细胞纯度。

1.2.2.4荧光定量PCR检测肝细胞TLR4、p38MAPK mRNA的表达从GenBank里查找基因TLR4、p38MAPK、IKKβ、NF-κB序列号，引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计并合成。TLR4：上游引物：5′-AAGTTATTGTGGTGGTGTCTAG-3′，下游引物：5′-GAGGTAGGTGTTTCTGCTAAG-3′，148 bp；p38MAPK：上游引物5′-TTGGTCTGTTGGATGTGTTTAC-3′，下游引物5′-TGGATTATGTCAGCCGAGTG-3′，193 bp；GAPDH：上游引物5′-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3′，134 bp。

PCR按照试剂盒说明书进行操作，采用25 μl反应体系，反应条件：①95℃持续30 s预变性；②95℃持续5 s变性；③GAPDH 57.5℃，TLR4 58℃，p38MAPK 58℃，退火20 s；④ 60℃持续30 s 延伸，②～④39个循环；⑤溶解曲线分析，70℃～ 90℃，持续5～10 s。反应完毕采用Opticon Monitor 3.1 软件分析，用公式2-△△Ct方法进行相对定量。

1.2.3Western印迹检测肝细胞TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达取适量裂解液，使用前先加入PMSF，使PMSF终浓度为1 mmol/L。计数细胞，按照每6×106个细胞加入1 ml RIPA裂解液，4℃，12 000 r/min离心5 min，根据碧云天公司BCA蛋白浓度试剂盒说明书对蛋白含量进行测定。肝细胞样本进行凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育、4℃过夜。洗涤后加入二抗，孵育，充分洗涤，然后进行化学发光。曝光、 显影、 定影,最后对结果进行光密度扫描分析。

1.3统计学处理采用SPSS13.0软件，计量资料采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时用S-N-K法进行组间比较，方差不齐时用TamhaneT2法检验。

2结果

2.1HE染色结果模型组大鼠肝组织切片脂肪变性明显，可见肝细胞肿胀、有气球样变，偶可见散在坏死的肝细胞，肝索紊乱，伴炎症细胞为主的肝小叶内、汇管区炎症浸润；胞质内可见大小不一的脂滴，呈圆形，以大泡性脂滴为主，部分细胞酷似脂肪细胞，胞核被挤压、靠向边缘。正常组大鼠肝组织结构完好，小叶结构清晰，肝窦结构正常，肝细胞结构完整，排列整齐，呈多边形，胞质红染，无空泡，胞核位于中央，无明显病变。各药物干预组大鼠肝组织脂肪变性及炎症浸润情况较模型组均有不同程度的改善，以合方高、合方低、健脾高剂量组改善最为明显。见图1。

图1　HE染色(×200)

2.2油红O染色结果模型组肝细胞肿胀，核质深蓝染色、靠边，胞质可见大片的红色脂滴，小叶结构破坏，肝索紊乱；正常组肝细胞排列整齐，胞核淡蓝居中，结构正常，胞质偶见正常散在的红染脂滴；各药物干预组红染脂滴量介于正常组与模型组之间，其中以合方高、合方低、健脾高剂量组脂滴较少。见图2。

图2　油红O染色(×200)

2.3血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量与正常组比较，模型组大鼠TC、TG、LDL-C均有显著升高，HDL-C均有显著降低(P<0.01)；与模型组比较，合方高、低剂量组、健脾高剂量组大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C显著改善(P<0.05，P<0.01)，健脾低剂量组LDL-C降低有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.4大鼠血清IL-1、IL-6、 TNF-α含量模型组大鼠血清IL-1、IL-6、 TNF-α与正常组比较含量显著升高(P<0.01)；各用药组与模型组比较，合方高、低剂量组IL-1、IL-6、 TNF-α含量显著降低(P<0.05，P<0.01)，健脾高剂量组IL-1、IL-6含量显著降低(P<0.05)；其余各组与模型组比较有下降趋势，但是差异无统计学意义(P>0.05)；各用药组间比较，与健脾低组比较，合方组TNF-α降低有统计学差异(P<0.05，P<0.01)，与健脾高组比较，合方高组IL-6显著降低(P<0.05)，见表2。

组别nTCTGHDL-CLDL-C正常组91.42±0.180.61±0.151.16±0.111.07±0.19模型组93.30±0.201)1.19±0.271)0.52±0.051)2.69±0.271)疏肝高组93.06±0.240.99±0.130.64±0.082.49±0.26疏肝低组93.22±0.291.07±0.220.53±0.162.56±0.35健脾高组82.54±0.273)0.94±0.203)0.69±0.092)2.06±0.292)健脾低组93.28±0.181.04±0.170.60±0.082.41±0.243)合方高组81.88±0.182)4)5)0.74±0.182)4)5)1.07±0.072)4)5)1.72±0.262)4)5)合方低组92.52±0.163)0.93±0.133)0.66±0.093)2.15±0.233)

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01,3)P<0.05；与健脾高组、合方低组比较：4)P<0.05；与疏肝组、健脾低组比较：5)P<0.01

2.5原代肝细胞的鉴定肝细胞组CK-18 抗体检测肝细胞，检测细胞1×104个，CK-18 受体表达细胞数为9 080个，细胞所占比为90.80%，则肝细胞纯度为90.80%。

组别nIL-1IL-6TNF-α正常组994.58±22.1362.20±15.63107.24±21.62模型组9185.29±25.081)147.27±16.611)241.43±25.031)疏肝高组9146.65±18.52126.12±11.58198.09±22.57疏肝低组9151.82±18.71130.21±12.72204.41±23.38健脾高组8120.17±16.842)115.35±11.13176.12±21.122)健脾低组9144.21±22.51126.19±14.85196.23±22.49合方高组8111.87±17.423)74.29±11.563)4)129.45±21.063)5)合方低组9122.55±17.322)81.20±11.653)133.53±21.632)5)

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；与健脾高组比较：4)P<0.05，与健脾低组比较：5)P<0.05

2.6肝细胞p38MAPK通路相关基因及蛋白检测模型组大鼠肝细胞TLR4、p38MAPK mRNA及蛋白与正常组比较表达量显著增加(P<0.01)；各用药组与模型比较，合方高、低剂量组，健脾高剂量组TLR4、p38MAPK mRNA及蛋白表达量显著降低(P<0.05，P<0.01)；其余各用药组与模型组比较均有不同程度下降趋势，但是差异无统计学意义(P>0.05)。用药组间比较，合方高、低组与疏肝组、健脾低组比较TLR4、p38MAPK mRNA及蛋白表达量显著降低(P<0.05，P<0.01)，其中合方高组TLR4 mRNA与健脾高组比较差异有统计学意义(P<0.01)，健脾高组与疏肝组、健脾低组比较p38MAPK蛋白表达显著降低(P<0.01)。见表3，表4，图3。

组别TLR-4p38MAPK正常组1(0.88～1.14)2)1(0.80-1.25)2)模型组4.89(4.12～5.81)1)4.56(4.06-5.13)1)疏肝高组3.93(3.70～4.17)3.76(3.43～4.14)疏肝低组4.18(3.69～4.73)4.01(3.52～4.63)健脾高组3.25(2.68～3.95)3)3.02(2.49～3.63)3)健脾低组3.98(3.51～4.50)3.95(3.57～4.38)合方高组1.59(1.37～1.86)2)4)6)7)1.82(1.49～2.22)2)4)8)合方低组2.01(1.59～2.77)2)2.39(1.88～3.05)2)5)7)

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05；与疏肝组比较：4)P<0.01，5)P<0.05；与健脾高组比较：6)P<0.01；与健脾低组比较：7)P<0.01，8)P<0.01

组别p38MAPKp-p38MAPKTLR4正常组0.94±0.040.28±0.060.27±0.09模型组2.04±0.071)1.01±0.081)1.01±0.081)疏肝高组1.85±0.080.89±0.090.82±0.09疏肝低组1.89±0.070.95±0.050.89±0.11健脾高组1.46±0.082)4)7)0.79±0.083)0.71±0.103)健脾低组1.82±0.120.90±0.070.83±0.12合方高组1.23±0.102)4)7)0.43±0.092)4)9)0.46±0.072)4)7)合方低组1.35±0.092)4)7)0.52±0.0462)4)7)0.55±0.092)4)6)

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05；疏肝组比较：4)P<0.01，5)P<0.05；与健脾低组比较：6)P<0.05，7)P<0.01；与健脾高组比较：8)P<0.05，9)P<0.01

A:正常组;B:模型组;C:疏肝高组;D:疏肝低组;E:健脾高组;F:健脾低组;G:合方高组;H合方低组图3　肝细胞p38MAPK信号通路相关蛋白灰度值比较

3讨论

NASH大多归属于中医肝癖、胁痛等病证范畴〔9〕。本实验采用高脂饲料喂养26 w后成功建立SD大鼠NASH模型，病理组织学表明肝脏脂肪变性同时伴有炎症和坏死，提示NASH大鼠模型建立成功，这与王敏等〔10〕的研究结果一致。

研究表明，在NASH疾病进程中，外周脂肪组织动员增加可导致游离脂肪酸(FFA)入肝增多，增强TG合成能力；HDL-C合成及分泌减少促使LDL-C合成增加，Ch含量升高，从而导致TG转运出肝减少，最终导致脂质代谢紊乱的病理演变〔11〕。本研究结果表明NASH大鼠存在脂质代谢紊乱；疏肝健脾方药可以明显改善NASH大鼠血脂代谢、减轻NASH大鼠肝组织脂肪蓄积，以合方高剂量组效果最佳，合方低剂量组与健脾高剂量组次之。

p38MAPK通路在MAPK信号通路中发挥重要作用〔12〕,是近年来信号传导领域研究的热点之一。p38MAPK在细胞炎症反应、细胞凋亡等过程中起重要作用〔13〕。p38MAPK通路的激活与炎症因子释放的机制复杂，研究表明〔14,15〕，阻断p38MAPK信号通路能够减轻炎症反应，抑制脂多糖诱导IL-1、IL-6及TNF-α等炎性细胞因子的释放。TLR4的活化是内、外源性内毒素诱导炎症发生的关键，它的激活在细胞内信号转导致肝损伤的发展过程中发挥着重要作用。TLR4和氧化应激的相互作用导致肝脏对TLR4的配体及细胞因子的敏感性增加，而加重肝损伤〔16〕。本研究结果提示，NASH大鼠肝细胞中存在TLR4、p38MAPK mRNA及TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白高表达，疏肝健脾方药对NASH大鼠肝细胞TLR4、p38MAPK mRNA及TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达有下调作用，其中以合方高、低剂量组，健脾高剂量组最明显，在26 w阶段疏肝健脾合方效果最佳。疏肝健脾方药可能是通过下调p38MAPK通路关键基因及蛋白发挥抗NASH作用。

循证医学研究表明：中医药对NASH的防治作用明确，疗效肯定〔17〕。本课题组前期研究表明，参苓白术散有明显降低血脂、改善肝脏脂肪变性，调控炎症反应、保护肝脏等作用〔18～20〕；另外，结合临床治疗观察发现NAFLD患者病因病机多为肝郁脾虚型，以此确立疏肝健脾法为基本治法，具有确切的疗效〔21〕，但具体机制未明。本研究结果显示，疏肝健脾方药能够改善NASH大鼠肝组织的脂肪变，下调炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的水平，明显调控大鼠肝细胞p38MAPK信号通路的活化，改善脂质代谢紊乱及炎性改变，但以合方组疗效最为显著。根据以方测证的方法，肝郁脾虚可能是NASH此阶段的基本病机，TLR4/p38MAPK蛋白可能是疏肝健脾方药发挥抗NASH作用的药物靶点。

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〔2015-04-15修回〕

(编辑曲莉)

Effects of Shugan-Jianpi prescriptions on TLR4/p38MAPK signaling pathway in hepatocytes of rats with NASH

LI Yuan-Yuan,YANG Qin-He,ZHANG Jin-Wen,etal.

Medical School of Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong,China

【Abstract】ObjectiveTo discuss the influence of Shugan and Jianpi methods and prescriptions on TLR4/p38MAPK signaling pathways in hepatocytes of rats with NASH and reveal the mechanisms.Methods120 SPF SD male rats were divided into 8 groups randomly. After 26 weeks,liver pathology of the rats was analyzed by HE and Oil red O staining.The levels of TC,TG,LDL-C,HDL-C in blood serum were detected. Then the levels of IL-1,IL-6,TNF-α of blood serum were analyzed by ELISA. Cell activity and purity were appraised by FCM technical. TLR4 and p38MAPK mRNA and protein expressions of hepatocytes were analyzed by fluorescence quantitative PCR and Western blot.ResultsThe levels of serum IL-1,IL-6,TNF-α were increased in normal group than those in model group (P<0.01). Comparing with those of model group,the levels of IL-1,IL-6,TNF-α were reduced significantly in high and low integrated prescriptions groups (P<0.05，P<0.01),the levels of IL-1,IL-6 were decreased in high Jianpi prescriptions group (P<0.05). The levels of TLR4,p38MAPK mRNA,protein phosphorylation p38MAPK in rats hepatocyte were increased in model group than those in normal group (P<0.01),and they were decreased in high and low integrated prescriptions,high Jianpi recipe groups than those in model group (P<0.05，P<0.01).ConclusionsShugan-Jianpi prescriptions could reduce the serum inflammatory factors and prevent liver′s steatosis of the NASH rats,and TLR4/p38MAPK might be the targets of Shugan-Jianpi prescriptions in the treatment of NASH.

【Key words】Shugan-Jianpi prescriptions;NASH;Hepatocytes;TLR4/p38MAPK signal pathway

通讯作者：杨钦河(1961-),男，教授，主任医师，博士后，博士生导师，主要从事中西医结合治疗肝病的基础与临床研究。

基金项目：国家自然科学基金项目(81273617，30973694；81302878)

中图分类号〔〕R575.5〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6649-05；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.004