结肠癌组织中P16、CyclinD1和PKC-α的表达及意义

姜晗，何巍，于安石，刘放

(沈阳医学院附属中心医院消化内科,辽宁沈阳110024)



结肠癌组织中P16、CyclinD1和PKC-α的表达及意义

姜晗，何巍，于安石，刘放

(沈阳医学院附属中心医院消化内科,辽宁沈阳110024)

摘要目的：研究P16、CyclinD1和PKC-α在结肠癌组织中的表达及其与结肠癌临床指标的关系。方法：采用免疫组织化学S-P染色方法检测P16、CyclinD1和PKC-α在70例结肠癌组织及癌旁组织中的表达。结果：结肠癌组织中P16蛋白阳性表达率明显低于癌旁组织，CyclinD1和PKC-α阳性表达率明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义。结论：结肠癌的发生与CyclinD1、PKC-α高表达和P16低表达均有关，P16蛋白可作为结肠癌早期诊断、临床生物学行为和预后评估的重要指标。

关键词结肠癌；P16；CyclinD1；PKC-α

结肠癌的发病率和死亡率在我国消化系统恶性肿瘤中位居第3位[1],临床上早期发现，早期诊断，准确评估预后至关重要，及时有效的治疗，可以提高患者的生存率，改善预后，发现高度敏感、高度特异的相应标志物，对于挽救结肠癌患者生命，降低其死亡率尤为重要。P16是目前发现的第1个直接抑制恶性肿瘤发生的基因蛋白[2]。其蛋白产物是细胞周期G1期到S期的调节蛋白,多数消化道恶性肿瘤组织中细胞周期素D1(CyclinD1)频发过度表达[3]。蛋白激酶C-α(PKC-α)是一类在细胞信号转导，增殖调控和肿瘤发生中具有重要作用的丝/苏氨酸蛋白激酶[4]。充分临床研究数据证明消化道恶性肿瘤的发生发展与P16、CyclinD1和PKC-α关系密切。本研究利用免疫组化法检测P16、CyclinD1和PKC-α在结肠癌组织中的表达，了解三者与结肠癌的关系，进而揭示其对结肠恶性肿瘤发病病因的意义。

1材料与方法

1.1实验材料搜集沈阳医学院附属中心医院普外科、消化科送检病理教研室的2015年1月至7月术后结肠癌和相应的癌旁组织标本70例。其中男性患者37例，女性患者33例，年龄35～84岁，平均年龄为61岁。高分化33例，中分化21例，低分化17例。有淋巴结转移39例，无淋巴结转移31例。Duke’s分期：A期3例；B1期14例，B2期12例；C1期19例，C2期19例；D期3例(肝脏转移)。

主要仪器：光学显微镜，石蜡切片机，染色缸，冰瓶高压锅等。

主要试剂：鼠抗人P16、鼠抗人CyclinD1单克隆抗体、SP试剂盒、DAB试剂盒购自北京中山生物制品有限公司，兔抗人PKC-α购自武汉博士德公司。

所有患者术前均未行放疗和化疗。标本均用 10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，所有组织均经病理学证实。

1.2实验方法常规免疫组织化学S-P染色方法，CyclinD1经微波抗原修复；P16、CyclinD1和PKC-α抗体的免疫产物均用过氧化物酶-DAB显色，抗体效价分别为1∶40、1∶50、1∶50；免疫组化阴性对照采用一抗为PBS替代，阳性对照为试剂盒提供的人结肠癌对照片。

1.3结果判定标准P16阳性主要表达在细胞浆及细胞核，CyclinD1阳性主要表达在细胞核，PKC-α阳性主要表达在细胞浆及细胞核，以细胞中相应部位出现棕黄色颗粒为阳性细胞。参照Fromowitz方法，在高倍镜下对细胞内反应如下评分：(1)无着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3[5]；(2)阳性范围：< 5%为0，5% ～25 %为1，26%～50% 为2，51%～70%为3，>70%为4[6]。两项结果相加<2为阴性(-)，2～3为弱阳性(+)，4～5为中度阳性(++)，6～7为强阳性(+++)[7]。

1.4统计学方法采用SPSS 18.0软件包进行数据处理。组间比较采用χ2检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1P16在结肠癌组织中的表达及与临床指标的关系结肠癌组织中P16阳性表达率为41.4%(29/70),明显低于癌旁组织[65.7%(46/70)]，并与Duke’s分期、分化程度、淋巴结转移有关(P﹤0.05)。见表1。

表1　P16在结肠癌组织中的表达与临床指标的关系

2.2CyclinD1在结肠癌组织中的表达及与临床指标的关系CyclinD1在结肠癌组织中阳性表达率为62.9%(44/70)，明显高于癌旁组织[47.1%(33/70)]，在Duke’s分期高、分化程度低、有淋巴结转移的癌组织中CyclinD1表达明显升高(P﹤0.05)。见表2。

表2　CyclinD1在结肠癌组织中的表达及与临床指标的关系

2.3PKC-α在结肠癌组织中的表达及与临床指标的关系结肠癌组织中PKC-α阳性表达率为65.7%(46/70)，明显高于癌旁组织[38.5%(27/70)]，并随着Duke’s分期高和分化程度低、有淋巴结转移明显上调(P<0.05)。见表3。

表3　PKC-α在结肠癌组织中的表达及与临床指标的关系

2.4结肠癌组织中P16、CyclinD1和PKC-α表达的相关性对结肠癌组织中P16、CyclinD1和PKC-α的表达进行相关性的分析，结果显示，结肠癌组织中CyclinD1和PKC-α具有明显的正相关性；P16和CyclinD1及PKC-α之间，均无明显相关性(P>0.05)。

2.5P16、CyclinD1和PKC-α在结肠癌组织中表达的病理结果P16、CyclinD1及PKC-α的免疫组化结果见图1～3。

图1　中分化结肠癌组织中P16表达(免疫组化染色×400)P16阳性主要表达在细胞浆及细胞核

图2　中分化结肠癌组织中CyclinD1表达(免疫组化染色×400) CyclinD1阳性主要表达在细胞核

图3　中分化结肠癌组织中PKC-α表达(免疫组化染色×400)PKC-α阳性主要表达在细胞浆及细胞核

3讨论

人体细胞的正常生长依赖于细胞周期中各种调节因子的平衡调控，任何一种调控因子发生紊乱将导致细胞异常增殖 ，从而诱发肿瘤[8]。已经证实，结肠癌的发生、发展过程涉及到多种基因的调控，细胞周期过程中癌基因蛋白的激活与抑癌基因蛋白的失活等是造成细胞恶性增殖、转化的重要因素。研究发现，P16、CyclinD1及PKC-α均为重要的细胞周期蛋白，任何因素导致这些蛋白异常表达时，引起细胞周期调节失控，导致肿瘤的发生和恶性演进[9]。

本研究可见，结肠癌组织中P16蛋白阳性表达率明显低于癌旁组织，临床分期A、B期高于临床分期C、D期；在高分化组阳性表达率明显低于中低分化组；无淋巴结转移组明显高于有淋巴结转移组。由此提示，结肠癌发生和发展与P16蛋白表达下调有关，有文献报道，结肠癌组织分化程度、Duke’s分期、淋巴结转移等与P16蛋白表达密切相关。它是直接作用于细胞周期的抑癌因子，将细胞周期控制和癌基因两个曾经独立的研究领域连接在一起，有可能成为癌症基因治疗的新方向。可考虑将P16蛋白作为判断结肠癌恶性程度的一个临床指标。CyclinD1、PKC-α在结肠癌中的过度表达，与结肠癌的分化程度、转移相关。二者随分化程度的降低、临床分期越高、转移的发生而出现表达量上调，在结肠癌的发生及发展中CyclinD1、PKC-α过表达关系密切。通过检测CyclinD1、PKC-α变化，可以帮助判断临床结肠恶性肿瘤患者肿瘤转移及恶性度、判断预后有着极其重要意义，为临床结肠癌治疗和评估预后提供有力帮助。

综上所述，本实验运用了免疫组织化学S-P染色方法研究了P16、CyclinD1和PKC-α在结肠癌及癌旁组织中的表达及其意义。CyclinD1和PKC-α明显相关，P16和CyclinD1及PKC-α之间均无明显相关。P16蛋白的表达下降及CyclinD1和PKC-α蛋白的过度表达可能导致细胞异常增殖为结肠癌的生物学行为的指标，为帮助临床结肠癌患者的治疗及进一步评估结肠癌患者的预后，进而采用更加有效的治疗措施有着重大意义。由于本实验经费和实验条件的限制，无法进一步从基因水平研究它们的作用机制，待今后条件允许后进一步完善。

参考文献：

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Expression of P16,CyclinD1 and PKC-α in Colon Carcinoma Tissue and Its Significance

JIANG Han,HE Wei,YU Anshi,LIU Fang

(Departrent of Gastroenterology,The Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College,Shenyang 110024，China)

AbstractObjective:To study the expressions of P16, CyclinD1 and PKC-α in colon caranoma tissues, and the their relationships with clinical index of colon carcinoma.Method:S-P immunohistochemical staining was used to detect the expressions of P16, CyclinD1 and PKC-α in 70 case of colon carcinoma tissues and adjacent tissues.Results:Possitive rate of P16 protein expression in colon carcinoma tissue was obviously lower than that in adjacent tissue，positive rate of CyclinD1 and PKC-α expressions were obviuosly higher than that in adjacent tissues.There were significant differences.Conclusions:The occurrence of the colon carcinoma has relation with high expressions of CyclinD1 and PKC-α, and the low expression of P16.P16 protein can be used as the important index of early diagnosis of colon carcinoma, clinical biological behavior and prognostic evaluation.

Key wordscolon carcinoma；P16；CyclinD1；PKC-α

收稿日期2015-07-19

doi:10.3969/j.issn.1008-2344.2015.04.007

中图分类号R135.35

文献标识码A

文章编号1008-2344(2015)04-0215-03

作者简介姜晗(1979—)，男(汉)，主治医师，研究方向：临床肿瘤病理学.E-mail:jianghan2002@163.com

基金项目沈阳医学院科技基金项目(No.20142047)