基质γ-羧基谷氨酸蛋白与肾结石形成

高兵

(沈阳医学院基础医学院细胞生物与遗传学教研室，辽宁沈阳110034)



基质γ-羧基谷氨酸蛋白与肾结石形成

高兵

(沈阳医学院基础医学院细胞生物与遗传学教研室，辽宁沈阳110034)

摘要肾结石形成以肾小管或肾间质的结晶异常沉积为特征，是一个多蛋白相互作用和多信号通路参与的复杂的生物学过程。与血管钙化机制类似，肾脏通过表达和分泌一些大分子蛋白参与和影响肾脏钙化。本文简介基质γ-羧基谷氨酸蛋白与肾结石形成的关系。

关键词肾结石；肾脏钙化；基质γ-羧基谷氨酸蛋白；蛋白质相互作用；信号通路

肾结石疾病是一种由环境因素、饮食因素和遗传因素引起的复杂疾病，以肾小管或肾间质的结晶异常沉积为特征，临床常表现为肾脏功能损害和尿路梗阻，发病率6%～12%，5年再发率达50%，并可终生多次再发[1]。肾结石的形成机制复杂，至今对其分子形成机制仍不清楚，导致目前临床缺乏有效的治疗和预防措施，而多以碎石、手术等方式暂时缓解症状，不能在肾脏钙化的发病机制上对结石形成进行有效的药物抑制和再发的预防。因此，阐明结石形成的分子机制对肾结石疾病的早期预防、防治再发等方面具有重要的意义。本文简要介绍基质γ-羧基谷氨酸蛋白(matrix Gla protein，MGP)与肾结石形成机制的研究进展。

1肾结石形成

肾结石形成是肾脏及其内外环境与基因之间复杂的相互作用的过程。泌尿系结石绝大部分都起源于肾脏，肾脏在保持和调节人体水、盐平衡，排除代谢废物的同时，易在肾小管形成盐的过饱和状态，在常见的代谢异常如高草酸尿、高钙尿的风险环境下，结晶沉积在肾小管或肾间质，导致肾脏钙化，结晶不断成核，聚集和生长，最终形成肾结石。在这个过程中，肾脏通过主动或被动的生物学行为表达和分泌一些大分子蛋白参与和影响结石形成。如我之前所在的研究小组首次在肾结石基质中发现的骨桥蛋白(osteopontin，OPN)，在肾小管上皮细胞表达，参与肾小管细胞和结晶的相互作用，调节结晶与肾小管上皮细胞的黏着，抑制结晶生长，其基因单体型变异也被发现与肾结石的发病风险密切相关[2-5]。近年来，尿中的其他大分子蛋白，如Tamm-Horsfall protein(THP)、bikunin和human urinary trefoil factor 1等也相继被发现与肾结石形成相关[6-7]。最近，Wright研究小组通过蛋白质组学研究在人尿中识别了1 063个蛋白，其中775个蛋白可能与肾结石形成相关[8]。尽管该研究没有深入探讨这些蛋白质之间确切的相互关系和对肾结石形成的影响，又存在较难展现肾小管上皮细胞内部生物学过程和分子功能的局限性，但是这些蛋白的发现暗示肾结石形成过程是一个复杂的相互作用的过程，包括蛋白质间的相互作用和蛋白质与无机物之间的相互作用。

2肾脏钙化

肾脏钙化表现为肾小管和肾间质的结晶异常沉积，是与肾结石形成密切相关的病理过程。肾脏钙化与血管钙化可能存在类似的形成机制，具有相似的特点：(1)钙化斑块样形态和成分上相似，研究发现血管钙化中钙磷沉积比率近似草酸钙肾结石成分[9]。(2)钙化过程中一些骨相关蛋白表达增高，可通过直接螯合钙离子或者调解化学诱导物质抑制钙化[10-11]。(3)钙化在风险因素持续存在或抑制物缺乏的条件下有生长的趋势并可导致一系列的生化反应，如炎症、损伤等，是主动的调节过程[11-13]。这些相似性提示2种钙化可能存在类似的机制，而某些大分子蛋白可能在2种钙化中发挥类似的作用。例如，上述OPN蛋白不仅在血管钙化中具有重要的钙化抑制作用[14-15]，而且其与肾脏钙化密切相关的事实也得到了公认[2-3]。我们推测，除已经公认的OPN蛋白外，某些证明在血管钙化中存在确定作用的蛋白可能在肾脏钙化中也发挥相似的作用。MGP蛋白是调节细胞外基质钙化的决定物质，已发现对血管钙化具有重要的抑制作用。MGP蛋白在骨、心、血管、肾脏、肺中均有表达，是一种维他命K依赖的分泌蛋白。MGP蛋白有5个γ-羧基谷氨酸残基，经过内质网γ-谷氨酰羧化酶羧基化修饰后与钙、磷离子和结晶具有高度的亲和性[16]。血管钙化研究中发现动脉粥样硬化斑块中MGP蛋白表达增加[17]；血管平滑肌细胞凋亡可引起MGP mRNA表达增加，其细胞凋亡小体可成为结晶核并有MGP蛋白表达[18]。MGP基因敲除小鼠出生6～8周后因全身动脉钙化崩溃而死亡，而恢复MGP蛋白在Mgp(-/-)小鼠血管的表达后可以阻止动脉钙化[9,19]。上述已经确定在2种钙化中均存在钙化抑制作用的OPN蛋白在Mgp(-/-)小鼠钙化动脉表达增加并聚合成大的蛋白复合物，诱导巨噬细胞参与钙化过程[20]，暗示OPN蛋白与MGP蛋白间存在着相互作用。在另一项研究中，研究人员用华法令(一种维他命K环氧化物还原酶化学抑制剂)通过阻断大鼠维他命K环氧化物还原酶系统抑制MGP的转录后修饰，结果发现这一处理降低了MGP的活性，并可观察到大鼠的血管广泛钙化[21]。这些结果揭示了MGP蛋白是调节细胞外基质钙化的决定物质，它通过表达和活性改变，并与其它钙化相关蛋白的相互作用共同发挥影响血管钙化的作用。但遗憾的是，这些研究都将研究重点放在了研究MGP在血管钙化方面的影响，而并未观察和研究其对肾脏钙化的影响和发挥的作用。

3MGP蛋白与肾脏钙化

我们课题组在国家自然科学基金的资助下，对MGP蛋白在肾脏钙化的作用进行了初步探索。在肾小管细胞研究中，我们发现MGP蛋白在草酸和草酸钙结晶刺激下表现为依时间梯度的上调表达[22]。研究发现MGP蛋白在正常大鼠肾小管亨利氏袢升支和远曲小管中表达，而在结石形成大鼠中则主要在乳头部集合管中表达，这与钙化抑制蛋白OPN和THP在正常鼠和结石鼠的表达定位一致和类似[3,23]；有研究发现结晶多沉积在MGP蛋白表达缺失的肾小管中，而正常表达MGP蛋白的肾小管中未见结晶形成，并观察到MGP蛋白存在于结晶的有机层结构中[24]。此外，我们还在中日两国人群的研究中发现MGP基因第4外显子的SNPrs4236(A/G)多态变异与肾结石发病风险相关[25-26]。这一发现与之前法国和爱尔兰的一项联合研究结果颇为相似，该研究发现SNPrs4236与冠状动脉硬化发病风险相关[27]，这也在一定程度上提示了MGP蛋白在肾脏钙化可能发挥重要的作用。另外，其他一些研究也发现MGP基因与肾结石形成相关，如日本的研究小组通过全基因组分析发现MGP基因在结石形成小鼠的肾脏表达增加[28]。这些研究提示MGP蛋白不仅是血管钙化的决定物质，还与肾脏钙化密切相关。但目前对MGP蛋白在肾脏钙化中的系统研究还很少。

3.1MGP蛋白与内质网应激MGP蛋白表达和活性是它发挥生物学功能的前提条件，其活性需要依赖内质网γ-谷氨酰羧化酶在维生素K提供能量驱动下完成，因此我们推测肾小管上皮细胞内质网功能的紊乱可能影响MGP蛋白的活性。内质网是蛋白质合成、折叠、运输以及细胞内钙离子储存的主要场所。钙平衡紊乱、糖基化抑制、氧化还原环境改变等均可使内质网内的微环境遭到破坏，而蛋白质折叠异常，蓄积在内质网内而诱发内质网应激。内质网应激直接影响应激细胞的转归，如修复、损伤或凋亡。低强度内质网应激下的细胞会产生持续性的细胞机能障碍，而过度的应激则会导致细胞死亡[29-30]。内质网膜上存在3种被称作内质网应激敏感器的膜蛋白分别是PERK(PRKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)、IRE1(Inositol Requirement 1)、ATF6(activating transcription factor 6)。这些蛋白在没有负荷的情况下在内质网膜内腔与分子伴侣蛋白Bip(Binding Protein)/GRP78(Glucose-Regulated Protein 78)结合处于非活性化状态。内质网应激发生时Bip/GRP78解离，PERK、IRE1及ATF6分别被释放而活性化[29,31]。PERK使eIF2a磷酸化可以抑制大多数的蛋白翻译。IRE1通过活性化转录因子XBP-1促进分子伴侣蛋白Bip/GRP78的表达。ATF6被释放后转移至高尔基体，接受膜内切断从而活化，作为转录因子促进分子伴侣的表达[29,31]。研究发现，血管平滑肌细胞MGP的活性和分泌与内质网γ-谷氨酰羧基化修饰密切相关[16,32]。研究发现肾结石患者的γ-谷氨酰羧化酶活性比正常人显著降低[33]。这些研究结果也为我们对内质网应激可能影响MGP蛋白活性和功能的推测提供了证据支持。

3.2MGP相互作用蛋白蛋白质-蛋白质相互作用决定着从转录调节到酶级连反应的几乎所有的生物功能，这方面的研究具有重要的科学价值和应用前景。新近发展出了很多在基因组水平上和蛋白水平上用理论方法和已知的蛋白互作网络数据库预测某蛋白及其相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的技术，对功能基因组研究具有十分重要的意义，有助于蛋白质功能的分析、疾病致病机理的阐明和治疗新药的开发等众多难题的解决，是目前生命科学的前沿领域之一。我们最近在一个包含多物种蛋白质互作信息的数据库中调查了MGP的可能相互作用蛋白，发现它与骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein 2，BMP2)存在相互作用。BMP2在血管钙化中通过激活NADPH氧化酶从而增加血管平滑肌细胞的内质网应激，介导细胞凋亡，促进血管钙化形成，而MGP蛋白通过结合BMP2而发挥抑制血管钙化的作用[34-35]。MGP和BMP2在肾脏钙化中的相互作用机制还不清楚。我们进一步在该数据库中的网络基础上分析MGP和BMP2的第一相关蛋白，得到BMP2的8个相互作用蛋白(ENG、SOSTDC1、ACTR2、BMPR1A、MGP、BMPR1B、BMPR2和COL2A1)。富集分析发现，其中主要有4个蛋白(BMP2、BMPR1B、BMPR1A和BMPR2)参与转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号传导通路和细胞因子与细胞因子受体相互作用信号传导通路。这些调查和分析为我们理解MGP相互作用蛋白提供了一些有益的重要线索。不足的是，数据库提供的MGP与BMP2的相互作用是用亲和层析法得到，可信度很高，但信息量有限。

3.3肾结石形成信号通路肾结石形成过程中，结晶、草酸等的毒性作用可诱导肾小管上皮细胞炎症、氧化应激和细胞损伤与凋亡等。这些生物学行为彼此关联，其发生发展与基因的表达模式变化密切相关。例如，研究发现，肾小管上皮细胞氧化应激ROS(reactive oxygen species)通过p38 MAPK/JNK信号通路激活转录因子(如NF-κB、AP-1)和TGF-β，进一步诱导OPN、Bikunin、MCP-1、MGP、BMP等的表达增加[37]；草酸钙结晶刺激下巨噬细胞可能通过TGF-β1信号通路诱导肾小管上皮细胞转分化[38]。这些研究主要聚焦少数基因/蛋白，缺乏从整体角度认识肾脏钙化的信号通路和分子机制，导致有关肾脏钙化的关键信号通路尚不明确。最近，我们利用上述Wright研究小组的蛋白质组学研究数据[36]得到839个肾结石相关候选蛋白，将这些蛋白组入人类生物学反应及信号通路数据库构建并分析相互作用网络，发现了7个关键蛋白，包括上述MGP的相互作用蛋白BMP2，这些蛋白都至少参与5个以上信号通路。近年来，转录组学研究成为在整体细胞和动物水平揭示疾病相关基因及其分子机制的重要方法。基因表达芯片已多次被用于发现肾结石差异表达基因，例如，Chen等[39]用0.75%乙二醇诱导结石形成鼠并执行肾脏Microarray分析，报告了345个表达差异基因。但这些芯片研究很少在整体网络水平对肾结石形成中基因之间的关系进行深入分析。

4展望

相较芯片技术，下一代测序技术可进行全转录组水平的表达差异基因研究，具有定量准确、可重复性高、更可靠的特点，还具有发现新的转录本、剪接变体等的优点。使用该技术分析结晶或草酸刺激下肾小管上皮细胞转录组表达差异基因，将能够进一步阐明MGP蛋白及其相互作用蛋白在肾小管上皮细胞整体转录水平的分子机制。

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Matrix Gla Protein and Kidney Stone Formation

GAO Bing

(Department of Cell Biology and Genetics,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China)

AbstractKidney stone formation is characteristic of aberrant crystal deposition in renal tubule and renal interstitial.It is a complex biological process including protein-protein interaction and many signaling pathways.Similar to vascular calcification, kidney expresses and secretes some macromolecular proteins to influence stone formation.Here, we introduced briefly the relation of matrix Gla protein and kidney stone formation.

Key wordskidney stone;renal calcification;matrix Gla protein;protein-protein interaction;signaling pathway

收稿日期2015-10-08

doi:10.3969/j.issn.1008-2344.2015.04.001

中图分类号R691.4

文献标识码A

文章编号1008-2344(2015)04-0193-04

作者简介高兵(1972—)，男(汉).教授.研究方向：肾脏钙化研究.E-mail：gaobingdr@hotmail.com

基金项目国家自然科学基金项目(No.81570632)