蛋白质组学在中医药高血压领域研究的进展*

2016-01-27李开言

中医研究 2016年5期

关键词：中医中药综述研究进展

李开言,王　军

(河南省中医药研究院中药所，河南郑州 450004)

蛋白质组学在中医药高血压领域研究的进展*

李开言,王军

(河南省中医药研究院中药所，河南郑州 450004)

摘要蛋白质组学从整体上研究生物体或组织、器官内全部蛋白质结构和功能，与中医基础理论的整体性和系统性不谋而合。高血压某一阶段病理变化的“证”，可能与机体在某一特定环境下所表达的蛋白质组存在必然联系。因此，蛋白质组学研究中医中药治疗高血压具有高效解码症候生物学基础的潜力，将是揭示“证”实质的有效手段。

关键词蛋白质组学；高血压；中医中药；研究进展；综述

传统的高血压研究是从单个作用机制入手，即先假设某种作用机制对高血压有影响，如肾素-血管紧张素-醛固酮系统[1]或交感神经系统[2]，验证后再进一步研究具体的作用机制。然而高血压是多因素、多靶点造成的结果，基于大量分子全面的研究是现代高血压的研究思路，如蛋白质组学，然后再分析具体的作用机制和致病机制[3]。中医学认为，生物机体与自然环境、五脏、六腑、五官这些不同层次的系统是统一的整体，研究每一部分时，都应探讨其与其他机体元素、各种外界条件之间的内在关系和内外联系，由此建立一种全面而深刻的认识和关系规律。而最先由Marc Wilkins提出的蛋白质组学[4]，从整体上研究生物体或组织器官内全部蛋白质结构和功能，与中医基础理论的整体性和系统性不谋而合[5]。高血压某一阶段病理变化的“证”，可能与机体在某一特定环境下所表达的蛋白质组存在必然联系[6]，因此，蛋白质组学研究中医中药治疗高血压具有高效解码症候生物学基础的潜力，将是揭示证实质的有效手段。

1蛋白质组学研究方法

蛋白质组学方法包括二维电泳(2-DE)和质谱(MS)[7]。2-DE能够高度分散蛋白质，但可预见的人类基因有30 000个，而且蛋白修饰和降解也能够导致蛋白质在胶上位置的转移，故不能仅靠蛋白质在胶上的位置来辨别蛋白。蛋白质的后续分析通过准确性和灵敏度高的MS分析进行。MS分析主要有两种离子化技术：基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)。MALDI-TOF-MS即使分析分子量大于100 000 kDa的大分子，时间也不超过1ms。而ESI-MS通过电喷射电离或喷雾器直接蒸发样本，常与液相(LC)联用，而LC分离步骤通常在检测之前应用。ESI-MS能够提供比MALDI-TOF-MS更可靠的蛋白鉴定。适合MS检测的银染，金属螯合物染色或荧光染色是复杂样品分析最佳的染色方法[8]。相比银染，荧光染色提供了更宽动态和线性定量范围的检测[9]。蛋白质分子可以在被分离前共价结合荧光分子或电泳后再结合荧光染料。不同的样本用不同的荧光标记后可以在同一个2-DE胶上电泳，从而对不同样本进行直接对照，避免胶与胶之间固有变化的影响。常用的商业染料是Cy3和Cy5荧光染料[10]，两者分子量几乎相同，蛋白质被标记后电泳迁移率几乎不受影响。

除了2-DE/MS，近来也发展了其他蛋白质组学平台，如非胶鸟枪蛋白质组学技术[11-12]，使用LC分离，自动串联MS分析，这种方法又叫做多维蛋白鉴别技术。该技术用于鉴别复杂混合物中用二维电泳难以鉴别的蛋白，包括基本的、高度疏水或极端分子量蛋白质。DELLES C[13]等用毛细管电泳与串联质谱合用，这种方法分辨率高、快速、可靠、可重复且价钱合理，能够分析包含数千个不同多肽和蛋白的复杂生物体液，适用于临床高通量分析。非胶分离技术如多维液相和同位素编码亲和标记物(ICAT)法[14]、稳定同位素标记、串联质量标记和最近的相对和绝对定量的同位素标记(iTRAQ)[15]，可以避免凝胶电泳点迹融合和共迁移的弊端，例如：iTRAQ被用于伯胺，消除对含有半胱氨酸多肽的依赖性。表皮生长因子诱导的磷蛋白质改变通过32P/33P标记的正磷酸盐而检测出来[16]。ICAT法可鉴别更高比例的信号蛋白[17]，而iTRAQ可检测更大比例的核糖体蛋白和转录因子。这些方法与样品分离兼容，可降低蛋白复杂性，允许低丰度蛋白质的测量，而且有利于自动化，定量和全面的蛋白质组学分析，最近被用于大范围的蛋白质组学研究。

2蛋白质组学应用于中医高血压症候诊断

近年来，不少学者运用蛋白质组学技术对中医高血压症候进行诊断。胡小勤等[18]通过蛋白质组学比较了高血压病气虚血瘀证和肝阳上亢证患者血清作用于体外培养的内皮细胞的差异蛋白点，发现差异蛋白有27个，其中11个蛋白上调，16个蛋白下调；说明基于细胞模型的中医证候蛋白质组学研究可行，并探讨了高血压同病异证可能的分子机制及其不同点。褚瑜光等[19]对高血压痰湿壅盛证患者血清蛋白质组学进行研究，采用弱阳离子纳米磁性微球捕获血清中的蛋白质，Ciphergen PBS-Ⅱc型蛋白质芯片阅读检测仪绘制成蛋白指纹图谱，使得差异蛋白点更为直观。4个蛋白质峰被识别为肝胆湿热证特异表达的蛋白质，并作为诊断标志，诊断的灵敏性为93.103%，特异性为92%。孙喜稳等[20]通过对高血压血瘀证患者血清致伤人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行差异蛋白质组学研究，结果顺乌头酸酶与高血压血瘀证高度相关。杨波等[21]观察高血压脑出血急性期肝阳化风证、恢复期阴虚风动证外周血单个核细胞的蛋白质差异表达变化，发现高血压脑出血发展的不同阶段可能与肌动蛋白、纤维蛋白原α链前体密切相关。

3蛋白质组学研究中药治疗高血压的致病机制

最近基因组学相关研究证明高血压的致病机制与大量基因及其变体有关，因此，可以预期更大数量的蛋白质在这一进程中具有诱发高血压的作用[22]。高血压可致肾损害。肾脏作为高血压研究的关键器官，以自发性高血压大鼠(SHR)为模型探索高血压肾脏的氧化应激研究越来越多。WILCOX等[23]认为氧化应激超过人体承受范围，极有可能引发高血压。CHABRASHVIL I等[24]发现动物高血压模型中，超氧化物如过氧化物、过氧化氢、氧化应激生物标记物在脉管系统和肾脏中都有所增加。罗珊珊等[25]研究了主治痰湿壅盛型高血压的半夏白术天麻汤对SHR肾脏蛋白表达的影响，发现与WKY对比，SHR的铜锌超氧化物歧化酶、过氧化物酶2等氧化应激蛋白表达量较低，而半夏白术天麻汤能使这些蛋白的表达上调，从而推测：SHR在高血压病理状态下，氧化应激调节能力降低，引起肾脏损伤；而半夏白术天麻汤使这些蛋白的表达上调，增强了肾组织的抗氧化应激能力，从而调节血压。此揭示了半夏白术天麻汤治疗高血压可能的作用机制。后来又通过Western研究明确了半夏白术天麻汤能上调铜锌超氧化物歧化酶，过氧化物酶2蛋白表达。张莺等[26]发现肝阳上亢型高血压大鼠在附子汤灌胃后，大部分眼结合膜充血，在运用平肝潜阳法治疗后，眼结合膜充血较前好转。用二维凝胶电泳分离平肝潜阳法治疗后高血压肝阳上亢证大鼠的蛋白质组图谱，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和数据库分析：与氧化应激相关的异柠檬酸脱氢酶、类固醇合成急性调节蛋白在肝阳上亢高血压大鼠组表达较高血压组上调，治疗后治疗组上述指标重新下调至前水平；铁轻链蛋白、Tu翻译延长因子、鸟苷酸解离抑制因子、黄素还原酶、Basic转录因子3在肝阳上亢高血压大鼠组表达较高血压组下调，治疗后治疗组重新上调至前水平，从而推断平肝潜阳法治疗与改善氧化应激及胰岛素抵抗有关。

4蛋白质组学的不足和发展趋势

蛋白的磷酸化、乙酰化和糖基化等复杂的翻译后修饰能够显著改变蛋白功能，但却不易被现有的蛋白质组学监测到[27-29]，因此，发展能够检测蛋白翻译后修饰情况的蛋白质组学技术更有利于高血压的研究。翻译后修饰也能发生在活体外，如果一个样品不立即冻存，就会继续进行翻译后修饰，组织和体液中蛋白酶的丰富性也将改变蛋白质学的种类。在样本储存过程中，细菌的过度生长也不是罕见的现象。血清蛋白质组学研究中，不完全离心、溶血和不完全凝血都会引起分析前的错误[30]。为了临床的特殊目的，样品的处理必须建立严格的标准，才能保证蛋白质组学研究的可靠性。

人类高血压在中年期间发展缓慢，在步入老年后对心血管相关疾病的发病率和致死率有很大影响。高血压成因是多因素、多靶点的，基因对高血压的发展有一定作用，环境因素如高盐饮食、肥胖和低心血管适应证等对高血压的发展也有很大作用。蛋白质表达受基因和环境的共同作用。蛋白质组学有利于研究基因与环境之间的相互作用以及环境对高血压的作用。运用蛋白质组学研究高血压的发病机制，寻找高血压发生前及发生各个阶段的生物标记物将对高血压的预防和诊断有重要意义。

5参考文献

[1]华琦,李东宝,陈海翎,等.比索洛尔对原发性高血压患者肾素-血管紧张素-醛固酮系统及血管内皮功能的影响[J].首都医科大学学报，2004,25(1):71-73.

[2]DONALD E,NOREEN F Rossi,EDWARD W,et al.Regulation of Blood Pressure and Salt Homeostasis by Endothelin[J].Physiol Rev，2011,91(1):1-77.

[3]DELLES C,NEISIUS U,CARTY DM.Proteomics in hypertension and other cardiovascular diseases[J].Ann Med ，2012,44(1):S55-64.

[4]WASINGER VC,CORDWELL SJ,CERPA-POLJAK A,et al.Progress with gene-product mapping of the Mollicutes:Mycoplasma genitalium[J].Electrophoresis，1995,16(1):1090-1094.

[5]齐连芬,李川洁,胡元会.蛋白质组学技术在高血压领域的应用[J].中西医结合心脑血管病杂志，2011,9(9):1100-1101.

[6]郭芳宏,魏嵋.运用蛋白质组学技术研究中医证候本质进展[J].现代中西医结合杂志，2010,19(13):1678-1679.

[7]MARTENS L,HERMJAKOB H,JONES P,et al.PRIDE:the proteomics identifications database[J].Proteomics,2005,5(13):3537-3545.

[8]WESTERN EIER R,MAROUGA R.Protein detection methods in proteomics research[J].Biosci Rep，2005,25(1-2):19-32.

[9]PATTON WF.A thousand points of light:the application of fluorescence detection technologies to two-dimensional gel electrophoresis and proteomics[J].Electrophoresis，2000,21(6):1123-1144.

[10]UNLÜ M,MORGAN ME,MINDEN JS,et al.Difference gel electrophoresis:a single gel method for detecting changes in protein extracts[J].Electrophoresis，1997,18(11):2071-2077.

[11]LU B,MCCLATCHY DB,KIM JY,et al.Strategies for shotgun identification of integral membrane proteins by tandem mass spectrometry[J].Proteomics，2008,8(19):3947-3955.

[12]HE P,HE HZ,DAI J,et al.The human plasma proteome analysis of Chinese serum using shotgun strategy [J].Proteomics，2005,5(13):3442-3453.

[13]DELLES C,NEISIUS U,CARTY DM.Proteomics in hypertension and other cardiovascular diseases[J].Ann Med，2012,44 (1):55-64.

[14]GYGI SP,RIST B,GERBER SA,et al.Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags[J].Nat Biotechnol，1999,17(10):994-999.

[15]SUN D,CHENG Y,ZHOU D,et al.Quantitative proteome of medulla oblongata in spontaneously hypertensive rats[J].J Proteome Res，2013,12(1):390-395.

[16]NAABY-HANSEN S,WARNASURIYA GD,HASTIE C,et al.Proteomic approaches in the analysis of hypertension[J].Methods Mol Med，2005,108:275-296.

[17]STEEN H,MANN M.The ABC's (and XYZ's) of peptide sequencing[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2004,5(9):699-711.

[18]胡小勤,曾学文,岑卫健.高血压病气虚血瘀证和肝阳上亢证比较蛋白质组学初步研究[J].中华中医药杂志,2013,28(2):532-534.

[19]褚瑜光,石洁,胡元会.高血压病痰湿壅盛证患者血清蛋白质组学研究[J].中西医结合学报,2009,7(7):629-635.

[20]孙喜稳,陈利国,王华强.高血压病血瘀证患者血清致伤HUVEC的差异蛋白质组学研究[G].中华中医药学会血栓病分会换届大会论文汇编：75-84.

[21]杨波,梁清华,熊新贵,等.高血压脑出血急性期肝阳化风证与恢复期阴虚风动证的蛋白质组学比较研究[J].湖南中医药大学学报,2014,34(10):34-38.

[22]SIMON R.Supervised analysis when the number of candidate features (p) greatly exceeds the number of cases (n)[J].ACM SIGKDD Explor Newslett,2003,5(2):31.

[23]ANTONIO CERIELLO.Possible Role of Oxidative Stress in the Pathogenesis of Hypertension[J].Diabetes Care,2008,31(2):181-184.

[24]CHABRASHVILI T,KITIYAKARA C,BLAU J,et al.Effects of ANG II type 1 and 2 receptors on oxidative stress,renal NADPH oxidase,and SOD expression[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2003,285(1):117-124.

[25]罗珊珊,蒋嘉烨,栗源.半夏白术天麻汤对自发性高血压大鼠肾脏蛋白表达谱的影响[J].中药材,2012,35(6):935-939.

[26]张莺,陈泽奇,钟广伟.平肝潜阳方治疗前后高血压病肝阳上亢证大鼠肾上腺组织蛋白表达变化的蛋白质组学研究[J].中西医结合学报,2008,6(7):729-737.

[27]熊继先.磷酸化蛋白质组学新方法的研究与应用[D].长沙：湖南师范大学,2010.

[28]刘金凤,王京兰,钱小红,蔡耘.翻译后修饰蛋白质组学研究的技术策略[J].中国生物化学与分子生物学报,2007,23(2):93-100.

[29]翁永强,邱双健,刘银坤,等.肿瘤标志物的蛋白质组学[J].世界华人消化杂志,2004,12(5):1188-1190.

[30]苟黎明,邵小宝,李克.蛋白质组学研究中高丰度蛋白质去除方法的研究进展[J].临床检验杂志，2010,28(4):298-300.

(编辑陶珠)

文章编号:1001-6910(2016)05-0073-03·综述·

中图分类号:R544.1

文献标志码:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.05.35

通信作者：王军，研究员，wj13513891329@163.com