清肠疏风凉血胶囊的质量标准研究

王维庭 王雪梅 徐恒雁 吕良

清肠疏风凉血胶囊的质量标准研究

王维庭 王雪梅 徐恒雁 吕良

目的建立清肠疏风凉血胶囊质量标准。方法确立清肠疏风凉血胶囊中黄芩、大黄、防风、麸炒枳壳和黄连的薄层色谱法(TLC)方法,确立黄芩中黄芩苷含量测定的高效液相色谱法(HPLC)方法。色谱条件：安捷伦ZORBAX SB-C18；色谱柱(250mm×4.6mm；5 μm)；流动相：甲醇-水-磷酸(47：53：0.2)；流速：1.0ml/min；检测波长：280 nm；柱温：25℃；进样量：10 μl。结果薄层色谱鉴别斑点显示清晰；高效液相色谱法定量准确,阴性对照无干扰。黄芩苷的检测浓度在0.105～1.575 μg,具有良好的线性关系(r2=0.9996),平均回收率为99.16%,RSD=0.70%(n=6)。结论本法简单,可行,操作简便,可以有效保证该制剂的质量。

清肠疏风凉血胶囊；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法

清肠疏风胶囊为龙口中医医院研制的医疗机构制剂,由炒槐花、黄芩、炒槐角、侧柏炭、黄柏、黄连等15味中药组成,具有清肠疏风、凉血止血之功效,主要用于治疗痔疮,属风热湿毒、伤及肠络证等。在本文中作者主要采用薄层色谱法和高效液相色谱法制定了清肠疏风凉血胶囊的质量标准,从定性和定量两个方面控制产品的质量,保证了该制剂的质量,保证患者用药安全。现将研究结果报告如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 DYQ-Ⅱ薄层点样器； KQ3200DE 型超声波处理器；Agilent 1260高效液相色谱仪；超纯水处理器；1/100000分析天平(Mettler ToledoAB204-N)。

1.2 试药 黄芩苷对照品(批号：110715-201436) ；色谱级甲醇。薄层色谱硅胶预制板(烟台市化学工业研究所),清肠疏风凉血胶囊(规格：0.4 g/粒,自制)。

2 实验方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 黄芩的鉴别［1］取内容物2 g,加乙酸乙酯与甲醇体积比为3:1的混合溶液30ml,加热回流30min,将溶液放冷后过滤,并将滤液蒸干,蒸干后的滤液放冷后再加入5ml的甲醇使溶解,取其上清作为供试品溶液。同法制成阴性样品溶液。再取汉黄芩素对照品,加甲醇制成0.5mg/ml的对照品溶液。吸取对照品溶液1 μl、供试品溶液和缺黄芩的阴性样品溶液各2 μl,点在聚酰胺薄膜上,置甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇 (10：3： 2：1)中展开,取出,晾干,置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与汉黄芩素色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性样品无干扰。

2.1.2 大黄的鉴别 取内容物6 g,加盐酸溶液(3→20) 10ml,混匀,加入三氯甲烷30ml,加热回流1 h,放冷,滤过,用分液漏斗分离取出三氯甲烷液,将三氯甲烷液蒸干,蒸干后的残渣用2ml甲醇溶解,将其作为供试品溶液。同法制成缺大黄药材的阴性样品溶液。再取大黄对照药材0.4 g,制成大黄对照药材溶液。吸取大黄对照药材溶液、供试品溶液和缺大黄的阴性样品溶液各5 μl,点于同一硅胶G板上,置甲苯-甲酸乙酯-甲醇-水-甲酸(6：2：0.4：1：0.1)的上层溶液中展开,取出,晾干,放置于氨试液饱和30min的展开缸内。供试品色谱在与大黄对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性样品无干扰。

2.1.3 防风的鉴别 取内容物5 g,加入30ml甲醇,超声25min,滤过,蒸干,残渣加水20ml溶解,乙酸乙酯洗3次,每次20ml,弃去乙酸乙酯溶液,用水饱和的正丁醇提取2次,每次20ml,合并正丁醇溶液,蒸干,加2ml甲醇溶解,作为供试品溶液。同法制成缺防风药材的阴性样品5 g。再取5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品,加甲醇制成1mg/ml的5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液。吸取5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液1 μl、供试品溶液及阴性样品溶液各5 μl,点于同一硅胶G板上,置三氯甲烷-甲醇(4：1)中展开,取出,晾干,喷10%硫酸乙醇,加热至显色清晰,置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色斑点,阴性样品无干扰。

2.1.4 枳壳的鉴别 取内容物2 g,加入乙酸乙酯25ml,回流1 h,滤过,蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品溶液。同法制成缺枳壳的阴性样品溶液。取柚皮苷对照品,加甲醇制成1mg/ml的对照品溶液。吸取柚皮苷对照品溶液1 μl,供试品溶液及阴性对照溶液各5 μl,分别点于同一硅胶G板上,以乙酸乙酯-甲醇-水(100：17：13)为展开剂,展距约为5cm,再置甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：10：1：1)的上层溶液的展开剂中,展开,取出,晾干,喷以三氯化铝试液,置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱在与柚皮苷对照品色谱相应位置上,显相同颜色斑点,阴性样品无干扰。

2.1.5 黄连的鉴别 取清肠疏风凉血胶囊内容物1 g,加入乙醇20ml,超声25min,滤过,浓缩滤液至约2ml,作为供试品溶液。同法制成缺黄连的阴性样品溶液。取黄连对照药材0.5 g,同法制成对照药材溶液。吸取黄连对照药材溶液1 μl,供试品溶液及缺黄连的阴性对照溶液各5 μl,点于同一高效硅胶G板上,置环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3：3.5：1：1.5：0.5：1)及氨蒸气饱和的展开缸内进行展开,取出,晾干,置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱在与黄连对照药材色谱相应位置上,显相同颜色斑点,阴性样品无干扰。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-C18 色谱柱 (250mm×4.6mm,5 μm)；流动相：甲醇-水-磷酸(47：53：0.2)；检测波长：280 nm；流速：1.0ml/min ；进样量：10 μl。理论塔板数按黄芩苷峰计算≥2500。

2.2.2 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品,精密称定,加甲醇制成约20mg/ml的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品约1 g,精密称定,加70%乙醇40ml,超声处理30min,放冷,滤过,精密量取续滤液1ml,置5ml容量瓶中,加70%乙醇稀释至5ml,取续滤液,即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 取缺黄芩的阴性样品,制成阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验 分别吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,结果显示阴性对照无干扰。

2.3.6 线性关系考察 分别精密吸取相当对照品0.105、0.315、0.525、1.050、1.575 μg的对照品溶液,注入高效液相色谱仪,得回归方程：Y=3485.8X+45.107,r2=0.9996,黄芩苷在0.105～1.575 μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 黄芩苷平均峰面积为3766.0,RSD= 0.03%,结果表明其精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 黄芩平均峰面积为2101.4,RSD=0.08%,结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 精密称取供试品6份,结果测定溶液中黄芩苷的平均含量为4.36mg/粒,RSD=0.98%,结果表明重复性试验良好。

2.2.10 回收率试验 取同批已知含量的样品约0.5 g,精密称定,取6份,分别加入黄芩苷5.0048mg(加入1ml含黄芩苷5.0048mg的溶液1.0ml) ,同法制成各试验溶液,测定各样品中黄芩苷的含量。结果显示,本品回收率均在95.0%～105.0%,RSD=0.70%,回收率良好。

2.2.11 黄芩苷的含量测定 按上述色谱条件,共检测9批本制剂样品的黄芩苷含量,结果范围在3.94～4.75mg/粒,考虑到差异,将本品黄芩苷含量限度定为每粒含黄芩苷 (C21H18O11)≥3.0mg。

3 讨论

3.1 定性鉴别研究 清肠疏风凉血胶囊是由15味药组成的中药制剂,成分复杂,因而在薄层色谱鉴别中对提取方法以及展开剂的选择上具有很高的要求。作者对本制剂中的黄芩、黄柏、黄连、大黄、防风、乌梅、荆芥、炒槐花等药材分别进行了薄层色谱鉴别的研究,其中黄芩、黄连的鉴别效果好,薄层色谱清晰,阴性样品无干扰,直接纳入质量标准中；大黄、防风和麸炒枳壳在薄层色谱鉴别试验中,因为分离效果不好,薄层色谱斑点不清晰,后来通过改变提取条件和展开剂系统,也达到了满意的效果,因此,大黄、防风和麸炒枳壳也被纳入标准；黄柏、乌梅、荆芥等其余药材或因为阴性存在干扰或未显示出有效特征斑点等原因,没有纳入该制剂的质量标准中。结果表明,清肠疏风凉血胶囊中黄芩、大黄、防风、枳壳和黄连等5味药采用文中薄层色谱方法进行定性鉴别,色谱特征斑点清晰,专属性强,可用于该制剂的定性鉴别。

3.2 流动相系统的选择 作者通过查阅相关的文献,试验了多种不同类型和比例的流动相系统,结果样品中黄芩苷的分离度不好,与其他色谱峰未分开,后经进一步摸索和多次尝试,发现用甲醇-水-磷酸(47：53：0.2)作为流动相,能够得到满意的特征色谱峰。

3.3 提取溶剂的选择 通过预实验,在供试品溶剂的制备中分别采用70%乙醇、75%乙醇和70%甲醇、75%甲醇进行提取。通过试验结果表明,75%乙醇、70%甲醇和75%甲醇作为提取溶剂,黄芩苷与其他色谱峰的分离度不好,而采用70%乙醇作为提取溶剂,黄芩苷与其他杂质分离度好,保留时间稳定,黄芩苷的含量符合要求。

4 讨论

疏风凉血胶囊是在槐角丸基础上结合临床经验化裁而成,方中炒槐花性凉苦降,能清泄血分之热,黄芩清热燥湿,泻火解毒,止血,共为君药［2］。炒槐角清降泄热之力较强,且能润肠,常用于痔疮肿痛出血之证,侧柏炭性凉味涩,既能凉血,又能收敛止血,主要用于血热妄行之证,黄柏、黄连清热燥湿,凉血解毒,除肠中湿热而止血,荆芥解表疏风,共为臣药。地榆炭凉血止血、解毒敛疮,大黄清热泻火,活血祛瘀,防风祛风解表、胜湿以祛外来之风,川芎活血行气,祛风止痛,与当归配伍,可增强活血散瘀、行气止痛之功,地黄清热凉血,三药理血行气,乌梅治内动之风,共为佐药。麸炒枳壳下气宽肠,引药下行,为使药。诸药合用,使湿化热清,风消血止,气畅腑清,共凑清肠疏风、凉血止血之功效。

本文作者主要对清肠疏风凉血胶囊质量标准进行了研究,确定了黄芩、大黄、防风、麸炒枳壳和黄连5味药材薄层色谱的鉴别方法,该方法简单易行,专属性强,可用于本品的定性检测指标；采用高效液相色谱法,以黄芩苷作为清肠疏风凉血胶囊含量测定的指标,在本色谱条件下特征峰不受杂质峰的干扰,方法专属性好,阴性无干扰。本标准所采用的供试品溶液制备方法简单,定性和定量指标方法专属性强、重现性好、灵敏度高,所建标准可用于本品的质量控制。

［1］国家药典委员会.中国药典(一部).北京:中国医药科技出版社,2010:322.

［2］赵志军,王连水.小柴胡颗粒薄层鉴别及黄芩苷含量测定方法的研究.中国实验方剂学杂志,2005,11(3):22-23.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.07.214

2015-11-06］

265701 龙口市中医医院(王维庭 吕良)；龙口市人民医院(王雪梅 徐恒雁)