乳腺癌患者中HPV和MMTV的基因检测
2016-01-26颜晨陈云新滕智平沈丹华李劲涛曾毅
颜晨 陈云新 滕智平 沈丹华 李劲涛 曾毅
100052中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室(颜晨、曾毅);100124北京工业大学生命科学与生物工程学院环境与病毒肿瘤学北京市重点实验室(滕智平、李劲涛);100044北京大学人民医院病理科(陈云新、沈丹华)
乳腺癌患者中HPV和MMTV的基因检测
颜晨 陈云新 滕智平 沈丹华 李劲涛 曾毅
100052中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室(颜晨、曾毅);100124北京工业大学生命科学与生物工程学院环境与病毒肿瘤学北京市重点实验室(滕智平、李劲涛);100044北京大学人民医院病理科(陈云新、沈丹华)
目的 在乳腺癌中检测人乳头瘤病毒和小鼠乳腺肿瘤病毒的存在,期望能为乳腺癌的基因治疗提供可能的靶点。方法 取76例乳腺癌石蜡组织,应用PCR和巢式PCR方法检测组织中HPV L1、HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6和HPV18E7,MMTV的env基因序列,并进行了测序分析。结果 在76份样本中,HPV L1阳性7例(9.21%),且测序后均为HPV18基因型;HPV16 E6和HPV16E7无阳性;HPV18 E6阳性5例(6.58%);HPV18 E7阳性7例(9.21%);MMTV的env基因阳性23例(30.26%)。结论 HPV18型相关基因与MMTV的env基因在乳腺癌中有存在,结果提示乳腺癌与HPV的相关性不是很高,但乳腺癌和MMTV或许有一定的相关性,也为乳腺癌的基因治疗提供了可能的靶点。
【主题词】 乳头状瘤病毒,人;乳房瘤病毒,鼠;乳腺肿瘤;聚合酶链反应
Fund programs:Nationa1 Key Techno1ogy R&D Program(2006BA119B03);Nationa1 High Techno1ogy Research Program of China(863 Program)(2012AA02A404)
乳腺癌是女性癌症中危害最大的癌症类型之一,但在50% ~80%的乳腺癌患者中找不到年龄、家族遗传史等常见原因,有研究表明乳腺癌与病毒感染相关,其中就包括小鼠乳腺肿瘤病毒和人乳头瘤病毒,其中人乳头瘤病毒已经证实和肛门生殖器癌、上呼吸消化道癌和皮肤癌的发生有着密切的关系[1];而小鼠乳腺肿瘤病毒的人类同源病毒即一种与小鼠乳腺肿瘤病毒具有一致性的逆转录病毒与人类乳腺癌相关[2]。
本研究分别在76例乳腺癌石蜡组织标本中检测了 HPV L1、HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6、HPV18E7以及MMTV的env基因序列,希望能进一步寻找乳腺癌与HPV和MMTV的相关性,为乳腺癌的基因治疗提供新的治疗靶点。
1 对象与方法
1.1临床材料 76例乳腺癌石蜡包埋样本取自北大人民医院病理科,其中35例乳腺浸润性导管癌Ⅰ级、25例Ⅱ级、14例Ⅲ级,1例导管内乳头状癌,1例乳腺浸润性小叶癌。该研究由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所伦理委员会审查通过,所有患者均已签署知情同意书。
1.2试剂 Premix Ex Taq,Proteinase K,均购自宝生物工程大连有限公司;HPV16 E6、HPV16 E7、HPV18E6、HPV18E7、HPV L1、MMTV nest PCR 7对引物均为美国Invitrogen公司合成;酚氯仿异戊醇混合液购自北京擎科新业生物技术有限公司;HPV18全基因质粒,HPV16全基因质粒与CM1细胞系为本实验室保存。
1.3方法
1.3.1石蜡切片基因组DNA的提取:应用水浴脱蜡法[3]提取石蜡切片组织中的DNA,具体步骤为:吸取60℃温热TES(10 mmo1/L Tris-Hc1,1 mmo1/L EDTA,0.5%SDS)滴至玻璃片样品区,用枪头轻轻刮下组织收集于1.5 m1EP管中,补加TES至1 m1震荡混匀,60℃水浴30 min,8000 r/min离心10 min弃上清,重复2遍,加入500 μ1 TET(100 mmo1/L Tris-Hc1,1 mmo1/L EDTA,1%TrisonX-100,500 μg/ m1 Proteinase K)震荡混匀,60℃水浴1 h至无沉淀,加入500 μ1酚氯仿异戊醇混合液混匀 20 min,13 000 r/min离心10 min,取上层清澈液体,此步骤重复2遍,加入1/10体积预冷NaAc(3 mo1/L)轻轻混匀,加入2倍体积无水乙醇缓慢摇动可见丝状DNA,4℃沉淀过夜,4℃12 000 r/min离心15 min,取沉淀加1m1无水乙醇4℃12 000 r/min离心15 min,清洗DNA,室温风干,加入40 μ1双蒸水溶解DNA,用蛋白核酸测定仪检测 DNA浓度,-20℃保存备用。
1.3.2PCR鉴定:分别设计合成HPV L1通用引物(上游:TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC,下游:GAA AAATAAACTGTAAATCATATTC)、HPV16E6(上游:GCAAGCAACAGTTACTGCGA,下游:CAACAAGAC ATACATCGACC)、HPV16E7(上游:TGCATGGAGAT ACACCTACATTG,下游:CCCATTAACAGGTCTTCC AAAGT)、HPV18E6(上游:CACTTCACTGCAAGACA TAGA,下 游:GTTGTGAAATCGTCGTTTTTCA)、HPV18E7(上游:ACATTTACCAGCCCGACGA,下游:ACACACAAAGGACAGGGTGTT)和MMTV巢式PCR内引物(上游:CCTTCCCTCGCCTAGTGTAGAT,下游:CTCTATCATTGGGATCCTTAGGAGAA)外引物(上 游:CCTTGGGTTACTTTGGGATTTCT,下 游:AACACAGGCAGATGTAGGAATCAT)分别进行PCR和巢式PCR鉴定。
PCR反应体系为Premix Ex Taq 25 μ1,模板2 μ1,上下游引物各0.5 μ1,双蒸水22.5 μ1;其中L1、HPV18E6、HPV18E7、HPV16E6、HPV16E7和MMTV内引物反应条件均为:94℃ 5 min,94℃ 30 s、54℃ 1 min、72℃1 min(40个循环)、72℃5 min;MMTV外引物第二轮反应条件为:94℃5 min,94℃30 s、56℃1 min、72℃1 min(40个循环),72℃5 min。
以HPV18全基因质粒为HPV基因扩增的阳性对照,以CM1细胞系DNA为MMTV的env基因扩增的阳性对照,以双蒸水为阴性对照。PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪观察结果并照相。
1.4统计学方法 应用SPSS软件对各项结果进行统计学分析。
2 结果
2.1本组病例年龄分布特点 76例样本平均年龄为54.81岁,最大87岁,最小25岁。HPV与MMTV病例数分散的存在于各个年龄段,未显示出年龄分布趋势。
2.2乳腺癌病例样本中PCR检测结果
2.2.1HPV基因PCR检测结果:76例乳腺癌样本进行HPV基因PCR扩增鉴定,结果显示HPV基因阳性11例(14.47%),L1阳性7例,其中3例HPV18 E6和HPV18 E7检测也为阳性,剩余4例切胶回收测序显示其序列也属于 HPV18基因型;HPV18 E6阳性5例,HPV18 E7阳性7例。分析可见在浸润性导管癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级中L1阳性率分别为4%、12%、28.57%,HPV18 E7阳性率分别为8%、4%、28.57%;HPV18 E6阳性率为0、8%、21.43%,可见HPV阳性集中于浸润性导管癌中,并且随着癌症的加重L1、HPV18 E6和HPV18 E7的阳性率随之上升。
2.2.2MMTV巢式PCR检测结果:巢式PCR结果显示乳腺癌MMTV env基因阳性23例(30.26%),其中乳腺浸润性导管癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级中的阳性率分别为20%、40%、50%。可见在浸润性导管癌中,随着癌症级数的增加,MMTV阳性率随之上升。
2.3HPV与MMTV阳性率与其他各国阳性率的比较
2.3.1乳腺癌中HPV阳性率各国对比:从以前报道中搜集了多国关于HPV在乳腺癌中的检测情况,分别发现叙利亚[4]HPV阳性病率61.06%,主要亚型包括HPV18(0.88%)、HPV16(2.65%)、HPV33 (55.75%)、HPV35(37.17%);墨西哥[5]无HPV阳性病例;而在墨西哥[6]另一次研究中HPV18阳性病例达到了50%;澳大利亚[7]HPV18阳性病例为48%;伊朗[8]HPV18阳性率6.9%,HPV16阳性率6.9%;而在瑞士[9]和中国西北[10]无 HPV阳性发现;在中国[11]另一次研究中 HPV18阳性率为1.61%、HPV16阳性率为4.84%。
分析显示此次结果和中国另一次研究以及伊朗研究的差异不具有统计学意义,此次结果与中国西北、瑞士,澳大利亚、墨西哥以及叙利亚的差异具有统计学意义。这一对比显示关于HPV在乳腺癌中的存在并未表现出地域差异性。
3 讨论
在本研究中76例乳腺癌患者平均年龄54.81岁,最大87岁,最小25岁,HPV与MMTV病例数分散的存在于各个年龄段,未显示出年龄分布趋势。
HPV的L1基因是编码主要衣壳蛋白的晚期基因,E6、E7基因为HPV的主要致癌基因、而HPV16、HPV18是主要致癌基因型。本研究选取HPV L1、HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6和HPV18E7基因作为目标基因,在乳腺癌样本中进行检测,HPV基因阳性11例(14.47%)且均为HPV18基因型,L1阳性7例也均属于HPV18基因型,其中3例HPV18 E6和HPV18 E7检测也均为阳性,说明在这3例乳腺癌样本中病毒已经进入组装阶段;而在6例乳腺癌样本中只能检测到HPV8E6或 E7,这提示了HPVE6、E7基因或许已进宿主DNA,处于潜伏感染阶段。本研究还分析在乳腺浸润性导管癌中,随着癌症的加重L1、HPV18 E6和HPV18 E7的阳性率随之上升。这提示了或许HPV的感染和乳腺癌的发生发展相关。收集多国检测结果对比显示关于HPV在乳腺癌中的存在并未表现出地域差异性,并且多国多次关于HPV与乳腺癌检测结果均不相同,这种文献矛盾出现的原因主要包括:乳腺癌样本中HPV的低病毒载量、各个研究所选用的引物各有不同、PCR检测中假阳性的存在等。所以关于乳腺癌和HPV关系的确定还需要更多、更大量、更统一的研究分析。
本研究在76例乳腺癌样本中检测了MMTV的env基因序列,其中鉴定阳性 23例,阳性率为30.26%,其中乳腺浸润性导管癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级中的阳性率分别为20%、40%、50%,显示随着癌症级数的增加,MMTV阳性率随之上升。
本研究主要针对乳腺癌样本中,HPV与MMTV人类同源基因的存在与否进行了检测,对MMTV人类同源基因在乳腺癌中的存在做出了一定的证实,为乳腺癌的基因治疗提供了新的靶点,但在本研究中,因为样品数量与检测靶点的有限性,尚需进一步的研究。
[1] Simoes PW,Medeiros LR,Simoes-Pires PD,et a1.Preva1ence of human papi11omavirus in breast cancer:a systematic review.Int J Gyneco1Cancer,2012,22:343-347.doi:10.1097/ IGC.06013e318238712e.
[2] Pogo BG,Ho11and JF,Levine PH.Human mammary tumor virus in inf1ammatory breast cancer,2010,116:2741-2744.doi:10. 1002/cncr.25179.
[3] 谭卓毅,丁梅,王保捷.福尔马林固定石蜡包埋组织中DNA提取.法医学杂志,2006:455-458.doi:10.3969/j.issn.1004-5619.2006.06.020.
[4] Aki1 N,Yasmeen A,Kassab A,et a1.High-risk human papi11omavirus infections in breast cancer in Syrian women and their association with Id-1 expression:a tissue microarray study. Br J Cancer,2008,99:404-407.doi:10.1038/sj.bjc.6604503.
[5] Herrera-Romano L,Fernandez-Tamayo N,Gomez-Conde E,et a1.Absence of human papi11omavirus sequences in epithe1ia1 breast cancer in a Mexican fema1e popu1ation.Med Onco1,2012,29:1515-1517.doi:10.1007/s12032-011-0059-x. Epub2011Sep11.
[6] Antonsson A,Spurr TP,Chen AC,et a1.High preva1ence of human papi11omaviruses in fresh frozen breast cancer samp1es.J Med Viro1,2011,83:2157-2163.doi:10.1002/jmv.22223.
[7] Kan CY,Iacopetta BJ,Lawson JS,et a1.Identification of human papi11omavirus DNA gene sequences in human breast cancer.Br J Cance,r 2005,93:946-948.doi:10.1038/sj.bjc.6602778.
[8] SigaroodiA,NadjiSA,NaghshvarF,eta1.Human papi11omavirus is associated with breast cancer in the north part of Iran.ScientificWor1dJourna1,2012,2012:837191.doi:10. 1100/2012/837191.Epub2012Apr1
[9] Linde1 K,Forster A,A1termatt HJ,et a1.Breast cancer and human papi11omavirus(HPV)infection:no evidence of a vira1 etio1ogy in a group of Swiss women.Breast,2007,16:172-177. doi.:10.1016/j.breast.2006.09.001.
[10] Chang P, WangT,YaoQ, eta1.Absenceofhuman papi11omavirus in patients with breast cancer in north-west China. Med Onco1,2012,29:521-525.doi:10.1007/s12032-011-9945-5.
[11] Mou X,Chen L,Liu F,et a1.Low preva1ence of human papi11omavirus(HPV)in Chinese patients with breast cancer.J Int Med Res,2011,39:1636-1644.doi:10.1177/147323001103900506.
Detection of HPV and MMTV in breast cancer cases
Yan Chen,Chen Yunxin,Teng Zhiping,ShenDanhua,Li Jintao,Zeng Yi National Institute for Viral Disease Control and Prevention,State Key Laboratory for Infectious Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100050 China(Yan C,Zeng Y);College of Life Science and Bioengineering,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China(Teng ZP,Li JT);Beiking University People′s Hospital,Beijing 100044,China(Chen YX,Shen DH)
Zeng Yi,Email:zengy@public.bta.net.cn
Objective To ana1yse the presence of human papi11omavirus and mouse mammary tumor virus in breast cancer,and expected to provide a possib1e target for gene therapy of breast cancer. Methods PCR and nested PCR assay were used to detect the HPV L1,HPV16E6,HPV16E7,HPV18E6,HPV18E7 and the eneve1op gene of MMTV,whi1e sequence ana1ysis was performed in 76 paraffin embedded tissues of breast cancer.Results The percentage of HPV L1,HPV18 E6,HPV18 E7 and the eneve1op gene of MMTV was repective1y 9.21%,6.58%,9.21%and 30.26%,whi1e no HPV16 E6 and HPV16E7 was found in 76 paraffin embedded tissues of breast cancer.Conclusions HPV18 and the eneve1op gene of MMTV was existed in breast cancer,there was 1ow connection between HPV and breast cancer,but there may be some corre1ation between MMTV and breast cancer.This research offers a possib1e target for gene therapy of breast cancer.
Papi11omavirus,human;Mammary tumor virus,mouse;Breast neop1asms;Po1ymerase chain reaction
国家科技支撑计划项目(2006BAI19B03);国家“863”计划课题(2012AA02A404)
曾毅,Emai1:zengy@pub1ic.bta.net.cn
10.3760/cma.j.issn.02546450.2016.02.018
2015-07-27)