加巴喷丁对糖尿病神经病理痛大鼠背根神经节FGF-2表达的影响

孙德旭，李向阳，王林，秦苏萍

(1徐州医学院人体解剖学教研室，江苏徐州 221004；2 徐州医学院病原生物学与免疫学教研室)



加巴喷丁对糖尿病神经病理痛大鼠背根神经节FGF-2表达的影响

孙德旭1，李向阳2，王林2，秦苏萍2

(1徐州医学院人体解剖学教研室，江苏徐州 221004；2 徐州医学院病原生物学与免疫学教研室)

摘要：目的观察加巴喷丁(GBP)对链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病神经病理性痛(DNP)大鼠背根神经节成纤维细胞生长因子2(FGF-2)蛋白表达的影响，以探讨其镇痛机制。方法将80只SD大鼠随机分为C组、DNP组、SC+DNP组和GBP+DNP组，各20只。除C组外，其他各组采用腹腔注射STZ建立DNP模型。SC+DNP组和GBP+DNP组在造模15天开始分别腹腔注射生理盐水、GBP(50 mg/kg)，每天1次，连续7 d。在造模前1天及造模后3、7、10、14、21、28天测定各组大鼠的缩足反射机械刺激阈值(PWMT)和缩足反射热辐射潜伏期(PWTL)；免疫组织化学法和Western blotting法检测大鼠背根神经节中的FGF-2。结果与C组相比，DNP组、SC+DNP组、GBP+DNP组造模后3、7、10、14、21、28天PWMT和PWTL低(P均<0.05)。与DNP组及SC+DNP组相比，GBP+DNP组造模后21天PWMT和PWTL高(P均<0.05)。造模后21天，DNP组、SC+DNP组和GBP+DNP组背根神经节内FGF-2蛋白含量较C组高，GBP+DNP组较DNP组、SC+DNP组低(P均<0.05)。结论 GBP可通过抑制DNP大鼠背根神经节内FGF-2的表达，从而减轻大鼠神经病理性痛。

关键词：加巴喷丁；糖尿病神经病理性痛；背根神经节；成纤维细胞生长因子2

糖尿病神经病理性痛(DNP)是糖尿病患者常见的并发症[1]。患者可出现自发痛、痛觉过敏、诱发触痛和其他不典型感觉异常，严重影响患者的生活质量，至今尚缺乏有效的治疗手段。研究[2,3]表明，活化的星形胶质细胞在神经病理性痛的发生过程中起重要作用，是维持慢性疼痛的重要因素。成纤维细胞生长因子2(FGF-2)最初在背根神经节内被发现，由初级感觉神经细胞和星形胶质细胞产生，能够激活星形胶质细胞，从而参与疼痛信号的转导过程，可见FGF-2与疼痛的关系非常密切。加巴喷丁(GBP)是一种常用的镇痛药物，是临床上用于治疗神经病理性痛的一线药物，镇痛疗效明确[4]，但其镇痛机制尚不明确。本实验旨在观察GBP对DNP大鼠痛觉行为及背根神经节FGF-2表达的影响，探讨其镇痛机理，为药物的应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试剂与仪器链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美国)，GBP(Sigma公司，美国)，多聚赖氨酸(武汉博士德)，FGF-2兔多克隆抗体(一抗，武汉博士德)，二步法(非生物素)免疫组化试剂盒(PV-9001，北京中杉生物有限公司)，BCA蛋白分析试剂盒(南通碧云天生物技术公司)，血糖仪(中国欧姆龙公司)，von Frey Hairs(美国Stoeling公司)，IITC series 8型热痛刺激仪(美国ITC公司)。

1.2实验动物及分组成年健康雄性SD大鼠80只，体质量200～220 g，由徐州医学院实验动物中心提供，采用随机数字表法，将其分为C组、DNP组、SC+DNP组和GBP+DNP组，各20只。

1.3DNP模型的制备及行为学指标检测参照文献[5]制备DNP模型，测定基础痛阈后皮下注射STZ 70 mg/kg，给药后第7天尾静脉血糖稳定且>16.7 mmol/L为糖尿病模型制备成功，给药后第14天痛阈降低幅度>基础痛阈15%为DNP模型制备成功。STZ使用时溶于0.1 mol/L新鲜配制的枸橼酸/枸橼酸钠缓冲液中(冰浴，pH4.5)，C组注射相同剂量的枸橼酸/枸橼酸钠缓冲液。SC+DNP组和GBP+DNP组于STZ注射第15天起分别腹腔注射生理盐水、GBP 50 mg/kg，每天1次，连续7 d，腹腔注射给予GBP方法参照文献[6]。在造模前1天、造模后3、7、10、14、21、28天，观察各组大鼠行为学指标，即缩足反射机械刺激阈值(PWMT)和缩足反射热辐射潜伏期(PWTL)。PWMT、PWTL检测参照文献[7,8]。

1.4 FGF-2检测方法各组大鼠在第14、21、28天分别选取6、8、6只，在4%水合氯醛40 mg/kg深度麻醉下，迅速将其断头处死，冰上操作取L3～L5背根神经节。①采用免疫组织化学法。取大鼠背根神经节置于4%的多聚甲醛中固定1 d，石蜡包埋，修块后连续切片，片厚4 μm，60 ℃烘干备用。切片常规入水，经微波修复后，0.01 mol/L的PBS漂洗2 min×3次，3%的去离子水孵育10 min，PBS漂洗2 min×3次，滴加一抗FGF-2(1∶100)4 ℃过夜，PBS漂洗2 min×3次，滴加聚合物辅助剂37 ℃孵育20 min，PBS冲洗2 min×3次，滴加辣根酶标记抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗2 min×3次，应用DAB溶液显色，自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗。显微镜观察见棕黄色为阳性，采用Olympus显微镜采集图像。②采用Western blotting法。用玻璃研磨器10倍于组织的冰裂解液将组织机械地捣碎，充分匀浆。冰上裂解30 min后用移液器将裂解液转移至1.5 mL离心管中。提取总蛋白并根据BCA法测定样本蛋白浓度后备用。取等量样本加至10% SDS-PAGE凝胶恒压电泳，缩胶电压70 V，分离胶电压140 V。湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后加兔抗FGF-2多克隆抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜；TBST冲洗，3×15 min，加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室温摇床孵育1.5 h，用PBS洗涤后进行增强化学荧光反应，加入NBT/BCIP显色液，待反应达到要求后，流水洗涤终止反应。所得条带用Image J软件进行光密度分析，获得数据后统计分析。

2结果

各组大鼠不同时间PWMT、PWTL比较见表1、2。光学显微镜下，大鼠背根神经节内见散在分布的FGF-2阳性细胞，其胞质及核内见有呈棕黄色颗粒的免疫反应产物。观察可见DNP组较C组阳性细胞数量多，阳性标记强度深；DNP组与SC+DNP组相比无明显差异；GBP+DNP组与DNP组比较，阳性细胞数量少，阳性标记强度弱。C组、DNP组造模后14天背根神经节FGF-2蛋白相对表达量分别为0.42±0.03、1.34±0.10，两组比较，P<0.05。C组、DNP组、SC+DNP组和GBP+DNP组造模后21天FGF-2蛋白相对表达量分别为0.45±0.32、1.41±0.63、1.23±0.36、0.78±0.41，C组与其他三组比较，GBP+DNP组与DNP组和SC+DNP组比较，P均<0.05；造模后28天四组FGF-2蛋白相对表达量分别为0.43±0.15、1.41±0.12、1.38±0.16、1.29±0.18，C组与其他三组比较，P均<0.05。

表1　各组大鼠不同时间PWMT比较

注：与C组相比，aP<0.05；与DNP组和SC+DNP组相比，bP<0.05；与同组造模前相比，cP<0.05。

注：与C组相比，aP<0.05；与DNP组和SC+DNP组相比，bP<0.05；与同组造模前相比，cP<0.05。

3讨论

由STZ诱导的糖尿病动物模型中，糖尿病导致外周神经损伤，引起初级传入伤害性感受器过度兴奋，包括背根神经节产生自发性脉冲，参与疼痛的形成[9]。背根神经节内的大量卫星细胞被激活，增生肥大，最终形成胶质疤，其标志物胶质原纤维酸性蛋白明显增多，并释放TNF-α等致炎因子，而TNF-α能够通过IL-1、Nav1.3、Nav1.8[10]等信号通路增强背根神经节内感觉神经元的兴奋性，并诱导背根神经节内的胶质细胞和神经元合成FGF-2[11]。本实验结果表明，正常大鼠背根神经节中FGF-2的表达较低，STZ诱导后14天背根神经节内FGF-2表达开始上调，第21天最高，此时大鼠的痛觉过敏、痛觉异常表现最为显著，提示FGF-2的生成与痛觉过敏呈现相同的趋势，提示FGF-2参与了神经病理痛的产生与维持。

FGF-2在周围和中枢神经系统内均有分布。在神经病理痛发生时，脊髓内的星形胶质细胞和神经节内卫星细胞FGF-2的表达含量增加，FGF-2是具有神经营养性的多效性细胞因子，能够激活星形胶质细胞，并影响神经元的兴奋性，共同参与疼痛的形成过程。脊神经结扎模型中FGF-2表达的上调参与了机械痛觉过敏，而Madiai等[12]研究亦证实，在坐骨神经结扎大鼠神经痛模型中，通过鞘内注射抗FGF-2抗体，可以减轻大鼠的机械痛敏。本研究中GBP+DNP组大鼠腹腔注射GBP 7 d后，PWMT和PWTL均得到有效改善，且FGF-2的表达也同步下降，说明GBP可通过抑制FGF-2的表达起到镇痛效果。

综上可见，DNP大鼠FGF-2表达升高，GBP通过抑制FGF-2的表达可以减轻DNP。但GBP如何调节FGF-2的表达，以及FGF-2通路的作用底物尚不明确，有待进一步的研究。

参考文献：

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收稿日期：(2015-07-24)

通信作者：秦苏萍

基金项目：徐州医学院院级科研课题(2014KJ)。

中图分类号：R322.8；R364.5；R441.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)47-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.009