坐骨神经分支选择性损伤大鼠脊髓背角γ-氨基丁酸能神经元的比例变化观察

陈朝辉，刘虹，刘洋

(1 川北医学院附属医院,四川南充 637000;2遂宁市中心医院)



坐骨神经分支选择性损伤大鼠脊髓背角γ-氨基丁酸能神经元的比例变化观察

陈朝辉1，刘虹2，刘洋1

(1 川北医学院附属医院,四川南充 637000;2遂宁市中心医院)

摘要：目的观察坐骨神经分支选择性损伤(SNI)模型大鼠脊髓背角γ-氨基丁酸(GABA)能神经元比例的变化。方法健康雄性SD大鼠36只，随机分为SNI组(S组)和假手术组(D组)，各18只。S组暴露左侧坐骨神经主干及三个分支，结扎切断胫神经和腓总神经，保留腓肠神经。D组仅暴露左侧坐骨神经主干及其分支，不行结扎。术前1天和术后7、14、28天分别进行大鼠左后爪内外侧机械痛阈测试。造模后7、14、28天两组大鼠分批取材(n=6)行4%多聚甲醛心脏灌注，取腰脊髓段(L5)制备石蜡切片，免疫组化染色定位GABA能神经元，并运用体视学形态定量分析两组大鼠脊髓背角GABA能神经元比例。结果S组大鼠术后7、14、28天左侧脊髓背角GABA能阳性神经元比例分别为60.41%±8.49%、55.27%±6.80%、61.87%±8.12%，右侧脊髓背角GABA能阳性神经元比例分别为61.94%±11.04%、64.68%±9.77%、62.58%±4.25%，D组大鼠术后7、14、28天左侧脊髓背角GABA能阳性神经元比例分别为61.27%±8.73%、63.59%±5.97%、62.81%±10.26%，右侧脊髓背角GABA能阳性神经元比例分别为58.02%±4.58%、60.84%±8.28%、63.74%±10.88%，S组术后14天左侧GABA能神经元比例较同组右侧、D组左侧低，P均<0.05。结论 SNI模型大鼠神经损伤侧脊髓背角GABA能神经元比例降低，但这种改变并不持久，GABA能神经元的转化可能与SNI大鼠机械性痛敏有关。

关键词：神经病理性疼痛；机械性痛阈；GABA能神经元；脊髓背角；体视学

神经病理性疼痛是神经系统损伤引起的一种难以治疗的慢性痛状态，其发病机制不明，治疗效果欠佳。坐骨神经分支选择性损伤(SNI)模型是神经病理性疼痛的常用模型，具有神经损伤程度固定、可重复性好、产生的行为学持久、能够提供接近模拟临床神经病理性疼痛的许多特征等特点[1]。有研究[2]表明，脊髓背角Ⅰ～Ⅲ板层γ-氨基丁酸(GABG)能神经元等抑制性中间神经元与神经病理性疼痛密切相关，但详细机制尚不明确。脊髓背角GABA能神经元在神经病理性疼痛发生过程中的变化和作用仍存在争议[3～5]。因此，本实验采用体视学的方法分析SNI大鼠脊髓背角GABA能神经元比例的变化，探讨神经病理性疼痛的机制。

1材料与方法

1.1实验动物与分组36只清洁级成年健康雄性SD大鼠，体质量260～310 g，由川北医学院动物实验中心提供,随机分为假手术组(D组)和SNI组(S组)，各18只。

1.2主要试剂和仪器 GABA多克隆抗体购自英国Abcam公司，免疫组化笔购自日本CIRISC公司，SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司；德国Leica切片机；意大利动态足底触觉仪(Ugo Basile公司)；日本培养倒立显微镜(TS100-F，Nikon公司)；丹麦Visopharm体视学图像系统。

1.3SNI模型制备腹腔注射3%戊巴比妥钠按(50 mg/kg)麻醉两组大鼠，S组大鼠麻醉后，俯卧固定于鼠板上，手术部位剪毛暴露皮肤，常规碘伏消毒铺巾，充分暴露并分离左侧坐骨神经三个分支(胫神经、腓总神经、腓肠神经)，用3-0医用真丝编织线结扎胫神经和腓总神经，并在结扎远端切断，保留完整腓肠神经，然后分层缝合肌肉和皮肤，缝合前在伤口处以30万单位/kg涂抹青霉素粉剂，并在右后腿肌注5万单位青霉素预防术后感染。D组大鼠麻醉后仅分离暴露三个分支后不做任何处理，分层缝合肌肉和皮肤，涂抹、肌注青霉素预防感染。

1.4大鼠一般行为学观察两组大鼠在实验造模前和取材前均测量体质量，作为评价其健康状况和生长情况的指标，同时记录各组大鼠术后一般情况。实验过程中，将大鼠放在动态足底触觉仪的长方形透明盒内，观察各组大鼠的活动状态、行走步态和后爪形态有无改变,并对大鼠的行为学情况[1级：活动状态正常，后爪无畸形；2级：活动状态正常，有明显后爪畸形(挛缩)；3级：轻度活动异常，有垂足现象；4级：严重活动异常，术侧后腿瘫痪]进行评估。

1.5大鼠机械性痛阈测试两组大鼠均在术前1天和术后7、14、28天采用动态足底触觉仪测量左后爪内侧面(隐神经区域)和外侧面(腓肠神经区域)的机械痛阈，以术前1天的测定值作为基础值，测定时间均为下午2点到4点。

1.6大鼠脊髓背角GABA能阳性神经元定位手术操作后7、14、28天，S组和D组分批取材(n=6)，腹腔注射3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉,200 mL生理盐水行心脏灌注，继以4%多聚甲醛固定液先快后慢灌注固定约300 mL,固定后取腰段L5脊髓组织,逐级乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋切片。常规脱蜡至水后，3% H2O2孵育10 min，经热抗原修复，5% BSA封闭液封闭20 min，滴加GABA多克隆抗体(1∶500)孵育(4 ℃)过夜。接着依次用生物素标记的羊抗鼠兔IgG孵育(37 ℃)20 min，0.01 mol/L的PBS漂洗3次，每次3 min后，滴加试剂辣根酶标记链酶卵白素(SABC)1～2滴，37 ℃孵育20 min，0.01 mol/L的PBS漂洗4次，每次5 min，最后在室温下用DAB显色5 min，苏木精复染2 min，0.5%盐酸乙醇分色,常规脱水、透明、中性树胶封片。

1.7大鼠脊髓背角GABA能阳性神经元比例观察取两组大鼠上述各时间点免疫组化染色效果较好的切片，采用Visopharm体视学图像系统及Olympus BX51型光学显微镜系统观察。每张切片中用Layer Drawing分别勾画出左侧与右侧脊髓背角，10倍物镜下叠加10×10个点，点面积24 020.99 μm2，统计所勾画范围内的点的个数(N)，然后在100倍物镜下叠加2个光学体视框，每个框左上角作为测点，框面积为55.00 μm×41.41 μm=2 211.6 μm2，设置抽样分数为7%，从切片表面下1 μm深度开始调节焦距，计数5 μm深度有效体视框内聚焦清晰的细胞数量。GABA能阳性与阴性神经元判断标准：阳性神经元细胞核大而圆，核仁明显，胞质内GABA递质着色呈棕黄色或黄褐色；阴性神经元细胞核大而圆，核仁明显，胞质不着色。每张切片分别按照以上方法统计GABA能阳性神经元的个数与阴性神经元的个数，估算脊髓背角手术侧与非手术侧的GABA能神经元数目占总神经元数目的比例。

2结果

2.1两组一般行为学比较术前两组大鼠体质量比较无明显差异，术后至取材前各时点两组大鼠体质量正常增长，两组同时点比较差异无统计学意义。所有大鼠术前体型及步态均正常，左后爪形态正常，反应及活动能力无异常。S组大鼠术后手术侧(左侧)后爪出现足外翻畸形、挛缩和自发性缩足反应，其中有4只大鼠评级达到3级，其余大鼠评级均为2级。D组大鼠术后活动、步态和后爪形态与术前比较无明显异常，评级均为1级。两组术后一般行为学比较，P<0.05。

2.2两组机械痛阈比较两组大鼠左后爪内外侧面机械痛阈比较见表1。

表1　 两组大鼠左后爪内外侧面机械痛阈比较±s)

注：与同组术前1天比较，*P<0.05；与对照组同时点比较，#P<0.05。

注：与同组右侧比较，*P<0.05；与对照组同时点比较，#P<0.05。

2.3两组脊髓背角GABA能阳性神经元比例比较免疫组化染色结果显示，大鼠脊髓背角GABA能神经元大小不等，体积以中小型细胞为主，GABA递质呈均质状分布于神经元胞质内，包绕细胞核。两组大鼠左右侧脊髓背角GABA能阳性神经元比例结果见表2。

3讨论

本研究中，S组大鼠术后出现左侧后爪外翻畸形、自发性缩足反应以及机械异常性疼痛等行为学变化，且这些改变持续了整个观察周期，而D组大鼠在整个观察周期均没有发现明显异常,两组比较差异有统计学意义。SNI大鼠后爪内外侧机械痛阈术后持续下降，术后各时点与术前基础值比较差异有统计学意义，D组大鼠后爪内外侧机械痛阈术后各时点与术前基础值比较，差异均无统计学意义，结果都与Woolf建立的SNI模型[1]一致，说明本实验大鼠SNI模型建立成功。

本实验结果显示，S组大鼠术后7、14、28天左侧GABA能神经元比例较右侧低，但仅14天时两侧比较差异有统计学意义。S组大鼠术后7、14、28天左侧GABA能神经元比例较对照组左侧低，但仅第14天时两组比较差异有统计学意义。SNI大鼠后脊髓背角术侧GABA能神经元比例在4周内出现了一个下降和回升的过程，这可能是GABA能神经元发生了凋亡坏死再生的过程，也可能是GABA能神经元发生了转化。Ibuki等[6]推测CCI大鼠1周后GABA能神经元的减少可能是因为GABA递质合成的下调。研究[7]发现，CCI大鼠GABA神经递质合成酶谷氨酸脱羧酶(GAD)阳性细胞数从术后3天在术侧和非术侧都开始减少，1周后开始回升，8周时已经超过正常值，因此推测CCI大鼠GABA能神经元内GABA递质减少，以至于胞质内的GABA浓度低于他们研究方法中的检测阈值，表现为原来呈GABA能阳性神经元转化为了“阴性”，低GABA递质水平作为刺激GABA合成酶GAD表达的正反馈调节信号，随着GAD表达的增加，GABA能神经元内GABA递质的合成逐渐增多，GABA能阳性神经元数量也呈现增长趋势，显现出一种神经元“自我修复”的状态。Polgar等[8]研究表明，脊髓中一些甘氨酸神经元表现出GABA免疫阳性。本实验研究中GABA能阳性神经元的数量在短期内发生了下降和回升，神经元本身再生的难度较高，我们推测，在GABA能阳性神经元减少的过程中，可能发生了神经元的转化，即原来呈GABA甘氨酸免疫双阳性的神经元在病理性疼痛过程中暂时转化成了甘氨酸免疫单阳性神经元。GABA是神经系统中重要的抑制性神经递质，在痛觉信息传导和调节中发挥重要作用，GABA能神经元在转化过程中由于GABA递质的数量发生变化，功能也可能发生变化，这可能与SNI大鼠机械痛阈的下降、机械性痛敏的发生有关。

以往学者大都是采用直接镜下计数等二维平面内统计方法，存在人为偏倚和误差，而本实验运用了公认的更为可靠的三维空间体视学形态定量方法[9]，通过在所测切片区域叠加适当的体视学探针，分别计数GABA能阳性神经元与阴性神经元个数，得到每张切片GABA能阳性神经元比例，用比例来作为估算GABA能阳性神经元数量改变的指标，排除了石蜡包埋前后组织体积变化的影响[10]，结果更加准确可靠。

综上可见，SNI模型大鼠脊髓背角GABA能神经元比例降低，且这种改变并不持久,GABA能神经元的转化可能与SNI机械性痛敏的发生有关。

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医药学名词常见错误及正确写法

药品名称：错误(正确)

二磷酸腺苷(腺苷二磷酸)，消炎痛(吲哚美辛)，阿斯匹林(阿司匹林)，维甲酸(维A酸)，双磷酸盐(双膦酸盐)，甲氨喋呤(甲氨蝶呤)，博莱霉素(博来霉素)，开浦兰(左乙拉西坦)，雷公多苷(雷公藤多苷)，非那根(异丙嗪)，四乙铵(四乙胺)，洗必泰(氯已定)，美息律(美西律)，大环内脂类(大环内酯类)，川穹(川芎)，酒精(乙醇)，头胞哌酮(头孢哌酮)。

疾病及其相关名称：错误(正确)

甲状腺机能(甲状腺功能)，血沉(红细胞沉降率)，X光片(X线片)，帕金森症(帕金森病)，食道(食管)，适应征、适应症(适应证)，禁忌征、禁忌症(禁忌证)，酒精肝(酒精性肝病)，心肌梗塞(心肌梗死)，脑梗塞(脑梗死)，毒副反应(不良反应)，肌肉注射(肌内注射)，心率失常(心律失常)，中风(卒中)，生理机能(生理功能)，返流(反流)，血液动力学(血流动力学)，机能(功能)，人流(人工流产)，药动学(药代动力学)，绿脓杆菌(铜绿假单胞菌)，机理(机制)，围产期(围生期)，氧和指数(氧合指数)，慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺疾病)，血管紧张素转换酶(血管紧张素转化酶)，血管紧张肽转换酶抑制剂(血管紧张素转化酶抑制剂)，咳血(咯血)，心房纤颤(心房颤动)，脑溢血(脑出血)，稳定性心绞痛(稳定型心绞痛)，法乐四联症(法洛四联症)，非何杰金淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)，视网膜神经胶质瘤(视网膜母细胞瘤)，剖腹产术(剖宫产术)。

其他：错误(正确)

粘附(黏附)，粘痰(黏痰)，粘液(黏液)，粘滞(黏滞)，粘膜(黏膜)，粘多糖(黏多糖)，多粘菌素(多黏菌素)，粘质沙雷菌(黏质沙雷菌)，层黏联蛋白(层黏连蛋白)，机率、几率(概率)，脱腊(脱蜡)，侧枝循环(侧支循环)，纵膈(纵隔)，红血球(红细胞)，白血球(白细胞)。

Proportion changes of GABAergic neurons in spinal dorsal horn of SNI rats

CHENZhao-hui1, LIU Hong, LIU Yang

(1AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China)

Abstract:Objective To observe the proportion changes of γ-aminobutyric acid (GABA)ergic neurons in spinal dorsal horn (SDH) of SNI (spared nerve injury) model rats.MethodsThirty-six healthy male SD rats were randomly divided into two groups: SNI group (group S, n=18) and sham operation group (group D, n=18). The left sciatic nerve trunk and three branches were exposed, two of which, known as tibial and peroneal nerve, were ligated and cut off, and the sural nerve was preserved to build the SNI model in the group S. The left sciatic nerve trunk and three branches were only exposed in the group D. On the 1st day before surgery, 7th, 14th and 28th days after surgery, the outside and inside MWTs (mechanical withdrawal threshold) of left hind paw in rats were tested. On the 7th , 14th and 28th days after surgery, rats in the two groups underwent cardiac perfusion of 4% paraformaldehyde, then the L5spinal segments were dissected to prepare paraffin sections. GABAergic neurons were labeled by immunohistochemical staining of GABA neurotransmitters in cytoplasm. The quantitative analysis of stereological morphometry was used to describe the proportions of GABAergic neurons in the two groups. ResultsThe proportions of GABAergic neurons in the left spinal dorsal horn of group S on the 7th, 14th and 28th days after surgery were 60.41%±8.49%, 55.27%±6.80% and 61.87%±8.12%, respectively, and in the right spinal dorsal horn of group S were 61.94%±11.04%, 64.68%±9.77% and 62.58%±4.25%. On the same way, the proportions of GABAergic neurons in the left spinal dorsal horn of group D on the 7th, 14th and 28th days after surgery were 61.27%±8.73%, 63.59%±5.97% and 62.81%±10.26%, respectively, and in the right spinal dorsal horn of group D were 58.02%±4.58%, 60.84%±8.28% and 63.74%±10.88%. Compared with the right SDH of the same group and left SDH of group D, there were statistically significant reductions in the proportions of GABAergic neurons of the left SDH on 14th day after SNI in the group S (all P<0.05).ConclusionSNI model may lead to the decrease of the proportions of GABAergic neurons in SDH of damaged side, but this change does not last long. The transformation of GABAergic neurons may be related to mechanical hypersensitivity

Key words:neuropathic pain; mechanical pain threshold; GABAergic neurons; spinal cord dorsal horn; stereology

收稿日期：(2015-08-12)

通信作者简介：刘洋(1969-)，男，博士，教授，主要研究方向为神经病理性疼痛基础与临床。E-mail: phoenixylly@sina.com.cn

作者简介：第一陈朝辉(1976-),男,硕士,副教授，主要研究方向为神经病理性疼痛机制。E-mail: 563504740@qq.com

基金项目：川北医学院科研发展计划项目(CBY12-A-ZP04)。

中图分类号：R441.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)47-0010-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.004