流式细胞仪三色荧光标记技术在白血病免疫分型中的应用

罗代平

（河南省濮阳市油田总医院 检验科，河南 濮阳 457001）

白血病患者临床并不少见，免疫分型检测对诊断、治疗及判断预后均具有重要临床意义。近年，国际上较为认同的方式为应用流式细胞术进行免疫分型，但仍没有统一的抗体标准，多采取商家提供的三色荧光标记抗体，具有一定局限性[1-2]。本研究旨在探讨采取自行设计的三色荧光标记抗体使用流式细胞仪进行免疫分型，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本科室收治的白血病患者120例入选本研究，均经患者及家属知情同意，且符合伦理委员会基本要求。其中，男79例，女41例；年龄20～65 岁,平均（37.6±9.9）岁；均为初治患者。法、美、英分型系统（French-American-British classification systems,FAB）分析：急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）74例；急性非淋巴细胞白血病（acute non-lymphocytic leukemia,ANLL）46例。

1.2 材料

本研究使用的抗体标记荧光素为异硫氰酸荧光素（FITC）/藻红蛋白（PE）/多甲藻叶绿素蛋白（PerCP）。单克隆抗体购自Becton Dickson Pharmingen公司。

1.3 方法

抽取120例患者外周血，均按常规方法分离为单个核细胞（mononuclear cells,MNC），其中，用单色荧光标记技术检测60例，三色荧光标记技术检测60例。

1.3.1 单色荧光标记技术 使用磷酸缓冲盐溶液（PBS）将MNC浓度调整为1×109/L,共11管，每管200 μl。各管分别加入以下单抗体20 μl:IgG1-PE、CD3-PE、CD7-PE、CD5-PE、CD13- PE、CD14-PE、CD19-PE、CD22-PE、CD33-PE、CD34-PE、Anti-HLA-DR-PE。

1.3.2 三色荧光标记技术 标本准备同上述，分别加入6种三色荧光抗体组合：①IgG1-FITC+IgG1-PE+CD45-Cy5；② CD10-FITC+CD19-PE+CD45-Cy5；③CD5-FITC+CD22-PE+CD45-Cy5；④CD14-FITC+CD34-PE+CD45-Cy5；⑤CD3-FITC+CD38-PE+CD45-Cy5；⑥CD7-FITC+CD13-PE+CD45-Cy5（均购自美国Pharmingen公司）。选择抗体T系特异性抗体CD3、CD5和CD7；B系CD10、CD19和CD22；髓系特异性抗体CD13、CD14、CD34和CD38。以上标本均经流式细胞仪分析。

2 结果

2.1 单色荧光标记技术检测结果分析

60例标本经单色荧光标记技术检测，T细胞免疫表型急性淋巴细胞白血病（T-ALL）27例，急性B细胞型淋巴细胞性白血病（B-ALL）11例，急性非淋巴细胞白血病（ANLL）22例；细胞分群问题致诊断不明确11例（18.3%）；初始诊断与最终诊断不符3例（5.0%），其中，2例为单纯髓系白血病，1例为单纯淋系白血病。

2.2 三色荧光标记技术检测结果分析

根据CD45/SSC二维分布图，计算淋巴细胞、单核细胞、粒细胞及幼稚细胞各群细胞比例，使用各抗体组合可把90%的白血病分为ALL和ANLL，并能对B-ALL、T-ALL、AML-M1/M2和 AML-M3做出正确诊断。

3 讨论

白血病临床并不少见，有异质性大、分型诊断复杂的特点，导致临床诊断难度较大[3-4]。白血病对患者影响巨大，严重威胁生命安全，不同分型诊断、治疗及预后差异较大，因此，正确的诊断对治疗具有关键作用。相关研究表明，三色荧光标记抗体组合对诊断白血病具有重要意义，采取CD45/SSC设门法，经多参数分析，可对不同类型不同分型的急性白血病进行明确诊断，尤其是AML-M4/M5诊断率较高。以往，临床诊断多采取CD14是否增高而进行判断，研究发现此类方法漏诊较高。此可能与CD14不见于幼稚细胞，故对幼稚细胞诊断漏诊率较低有关。研究发现，多数幼稚细胞均表达CD34、CD117及HLA-DR，且多伴有CD13、CD33阳性表达[5]，本研究所采取三色荧光标记法进行流式细胞仪检测可增加诊断正确率，三色荧光标记可应用较少的抗体组合对白血病血液标本进行多参数分析，对白血病细胞进行正确免疫分型，尽可能为临床中分型提供可靠依据，具有重要临床价 值。

[1]刘艳荣,于弘,常艳.探讨流式细胞仪检测抗原的方法及其在白血病免疫分型中的意义[J].中国实验血液学杂志,2002,21(10):17-21.

[2]郑列琳,刘征辉,陆廷伟.105例成人急性白血病形态学与免疫学分型的比较研究[J].中华血液学杂志,1996,17(4):206-207.

[3]刘艳荣,于弘,常艳,等.四色荧光标记抗体在白血病免疫分型中的应用及意义[J].中国实验血液学杂志,2002,21(10):423-427.

[4]Ichinohasama R,Decoteau JF,Myers J,et al.Three-color flow cytometry in the diagnosis ofmalignant lymphoma based on the comparative cell morphology of lymphoma cells and reactive lymphocytes[J].Leukemia,1997,11(11):1891-1903.

[5]胡永军,金恂,张晓飞.流式细胞免疫表型分析在恶性淋巴瘤诊断中的应用研究[J].交通医学,2011,25(5):443-446.