miRNA与多发性硬化的研究进展

杨挺嘉　殷旭华　丁枫

miRNA与多发性硬化的研究进展

杨挺嘉殷旭华丁枫

010059内蒙古医科大学附属医院神经内科〔杨挺嘉(现为内蒙古医科大学2013级在读研究生)、殷旭华〕；010059内蒙古医科大学基础医学院(丁枫)

摘要:micro RNA(miRNA)是一类长度约为19～25个核苷酸的非编码单链RNA分子，通常在转录后水平调控靶基因的降解或抑制翻译。越来越多的证据表明，miRNA可通过靶向免疫系统中关键信号转导分子的表达，从而在多个环节上参与调控机体的固有免疫反应和适应性免疫反应。多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种累及中枢神经系统的自身免疫性疾病，最近研究发现，多种miRNA在介导MS致病过程中起关键作用。本文就miRNA 在T细胞分化和发育以及在MS中的作用进行综述。

关键词:多发性硬化；微RNAs；T淋巴细胞

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病，是青年人非创伤性神经残疾的首要原因。在致病性和分子遗传水平，MS有5个主要的、相互作用的特征：(1)MS的严重性与进行性脱髓鞘的程度相关；(2)MS的特征包括轴索肿胀和巨噬细胞活化；(3)T细胞介导的炎性反应，触发免疫细胞释放促炎性细胞因子，如白细胞介素-1β(IL-1β)；(4)血-脑脊液屏障通透性改变；(5)促炎性的micro RNA(miRNA)和相关致病生物标志物增加[1-3]。MS的发病机制涉及复杂的遗传、表观遗传、微生物和/或环境因素，最近研究发现，中枢神经系统的miRNA有潜在的诱导作用[2]。本文就miRNA 在T细胞分化和发育以及在MS中的作用进行综述。

1miRNA的功能

miRNA是一类由19～25个核苷酸组成的小的非编码RNA，可以调节基因表达。估计约33%的人类基因由miRNA调节，一个miRNA可以潜在调节多个mRNA靶基因(平均200个)，一个基因也可以受多个miRNA调控，由此形成庞大的调控网络。目前已确定的人miRNA超过1500个(http://www.mirbase.org)，它们与一些主要的疾病相关联，如自身免疫性疾病和癌症。miRNA在免疫细胞中高度表达[4]，并参与固有免疫应答和适应性免疫应答[5]。据报道，miRNA是维持免疫耐受的关键,在miRNA的合成过程中，Dicer酶和Drosha酶的缺失可以导致T细胞的异常和自身免疫性疾病[6]。在不同的免疫细胞亚群中，miRNA的转录不同，表明初始、效应和记忆性T细胞[7]以及调节性T细胞的功能[6]依赖于miRNA调控。重要的是，miRNA能够通过细胞旁分泌形式表达，并在许多不同的生物体液(脑脊液、血清、尿液和唾液)中被检测出来[8]。

2miRNA 调控T 细胞活化与MS 的发病机制

越来越多的研究表明，CD4+T 作为效应 T细胞的主要成分，其介导的自身免疫反应在MS发病过程中发挥关键作用。经典免疫学将 CD4+T 细胞分为Th1 和 Th2 两个亚群。Th1细胞主要分泌干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子，介导细胞免疫，具有清除细胞内病原微生物、抗肿瘤等作用；Th2 细胞主要分泌 IL-4 等细胞因子介导体液免疫，参与清除细胞外病原微生物及变态反应。IFN-γ和IL-4相互拮抗，调控 Thl 和Th2细胞的分化。Th17 细胞是近年来发现的一种新型的CD4+T 细胞亚群，能够特异性地产生IL-17。虽然已发现许多miRNA在MS中表达失调，但只有部分miRNA的功能被阐述，下面就目前已知的一些 miRNA 在T细胞的分化和发育以及在MS中的作用做相关阐述。

2.1miR-30a miR-30a基因位于人染色体 6q13。研究发现，在 MS和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物模型(为研究MS的理想动物模型)急性发病期，miR-30a 表达水平下降，IL-17的表达水平升高，两者呈负相关；而在EAE小鼠体内过量表达 miR-30a时，EAE小鼠病情则缓解，表明miR-30a 可能调控Th17 分化过程中相关重要转录因子的表达。研究发现，细胞因子信号传导抑制蛋白1(SOCS1)和干扰素调节因子4(IRF4)均参与调控Th17 细胞的分化[9-10]。SOCS1主要通过抑制JAK-STAT信号通路发挥作用[11]，缺失SOCS1的CD4+T 细胞主要分化为Th1，少数分化为Th17[9]。文献报道，体外诱导Th17 分化过程中，IRF4 是IL-6和转化生长因子-β(TGF-β)介导Th17细胞分化通路中的必需成分[10]。体内敲除IRF4的小鼠不易诱导形成 EAE。通过microRNA靶基因预测软件发现，SOCS1和IRF4这两个分子的 3′非编码区碱基序列可以与 miR-30a 的序列通过碱基互补配对，阻断或降低SOCS1和IRF4的表达，减少体内炎性反应，对EAE发病起拮抗作用。增加内源性miR-30a的表达可作为治疗MS新的潜在方法。

2.2miRNA-146a miRNA-146a位于人染色体5q33.3，由22个核苷酸组成(5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′；59%A+U；NCBI基因ID：406938)，是一种迅速诱导的、促炎性反应的miRNA，在人中枢神经系统中具有相对较短的半衰期(约1.5～2.0 h)[12]。研究发现脑内皮细胞中的miR-146a通过抑制多个基因来抑制核转录因子kappa B(NF-κB)活化并负调节T细胞的黏附。NF-κB可驱动细胞黏附分子、趋化因子和促炎性细胞因子转录，在一些自身免疫疾病如MS中发挥核心作用[13]。NF-κB不仅启动编码蛋白质的基因转录，也驱动pre-miRNA的表达，pre-miRNA可反馈调节NF-κB的活性[14]。miR-146a是一个NF-κB依赖性基因，并且通过抑制人单核细胞中肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)和白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK1)的信号转导下调NF-κB的活性[15]。在培养的脑、脐静脉或视网膜的内皮细胞中，抑制NF-κB的活性可降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导渗透性和/或白细胞迁移[16]。在体内，用试剂阻断NF-κB的活性可减少MS的发病率和EAE的临床评分[17]。研究表明，内皮细胞的miR-146a抑制NF-κB活化可减少Jurkat T-细胞和初级T-细胞黏附到脑血管内皮细胞，从而对MS及EAE疾病的发展产生影响[18]。增加内源性的miRNA-146a可能作为治疗MS新的潜在方法。

2.3miR-873 通过采用miRNA芯片和RT-PCR方法，在EAE模型小鼠和经IL-17刺激3 h后的星形胶质细胞中，有11种miRNA有不同程度的上调，其中以miR-873的上调最为显著，它能明显抑制A20(TNF-induced protein3, TNFAIP3)的表达并能降低野生型重组A20 3′-UTR荧光素酶的活性。用荧光素酶报告基因技术和Western blot检测EAE模型小鼠和IL-17刺激3 h后的星形胶质细胞发现，miR-873可直接靶向调节A20 mRNA，并显著抑制A20蛋白表达[19]。

A20是一个具有双重功能的泛素编辑蛋白，可负调节NF-κB驱动基因的表达，是炎性反应调控的中心，与一些严重的自身免疫病有关，包括MS[20]。A20缺陷小鼠过早死于自发多器官炎性反应和恶变。沉默A20基因可明显加重EAE小鼠脑和脊髓组织病变。NF-κB驱动星形胶质细胞活化可使EAE病程加重[21]。在IL-6和IL-17的刺激下，星形胶质细胞中趋化因子表达增多，以募集T细胞到中枢神经系统中[22]。在IL-17的刺激下鼠原代星形胶质细胞中miR-873显著上调，miR-873的过度表达可抑制A20蛋白的表达，促进NF-κB的磷酸化，导致体内、外炎性反应因子和趋化因子如IL-6、TNF-α、巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和单核细胞趋化蛋白-5(MCP-5)增多[19]。更重要的是，在体内抑制内源性miR-873可明显减轻炎性反应和脱髓鞘，改善EAE进程。miR-873能够通过影响A20的表达和NF-κB的活化调控由IL-17刺激的星形胶质细胞IL-6、TNF-α、MIP-2和MCP-1/5的表达，从而对MS及EAE疾病的发展产生影响[19]。

2.4miR-155 miR-155位于人染色体21q21.3，由23个核苷酸组成(5′-UUAAUGCUAA-UCGUGAUAGGGGU-3′；61%A+U；NCBI：AF402776)，是一个在NF-κB调控下转录诱导的miRNA[23]。在炎性细胞因子的刺激下，miR-155在淋巴细胞(包括B细胞和T细胞)中高度表达，并且最新的证据表明它在固有免疫应答和免疫适应性应答中有重要作用[24]。研究发现miRNA-155在相关免疫病理状态中(包括MS、唐氏综合征、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮)均上调，进而影响T淋巴细胞和血-脑脊液屏障的功能[25]。研究发现，随EAE的进展，miR-155在脾、淋巴结和大脑中表达显著增加，并且敲除miR-155的小鼠CNS炎性反应和EAE的发病程度显著减轻[26]。miR-155的作用机制：(1)作用于CD47 3′-UTR，促使脑细胞CD47表达下调，触发巨噬细胞介导的髓鞘吞噬作用[27]；(2)诱导Th1细胞亚群和Th17细胞的分化[1,24]。最近研究表明，抑制miR-155的表达可抑制Th1和Th17细胞的分化，导致EAE疾病严重程度降低[28]；抗miR-155治疗可显著抑制EAE病情进展[1,24]。因此，抑制miR-155的表达可能成为MS潜在的治疗靶点。

2.5miR-132/212簇 miR-132和miR-212在脊椎动物中有着相似且高度保守的序列，位于人染色体17p13.3，在基因组中呈现串联排列，称为miR-132/212基因簇。最近研究表明，miR-132/212簇在Th17分化和EAE的发病中起重要作用。miR-132/212簇的表达取决于芳香烃受体(arylhydro-carbon receptor，AHR)。某些研究表明，AHR通过调节调节性T细胞(Treg)和Th17细胞的平衡，在自身免疫性疾病如EAE中起关键作用[29]。研究发现，AHR活化诱导miR-132/212簇的产生，并且增加AHR介导的Th17细胞产生，miR-132/212群集和AHR形成一个正反馈环路[30]。miR-132/212群集在神经元的高度表达受转录因子环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)调控，cAMP激活AHR，导致AHR易位进入细胞核[31]。研究结果显示CREB和AHR信号之间相互作用，诱导miR-132/212产生[30]。研究发现miR-132/212簇缺乏可降低Th1和Th17细胞的比例，抑制EAE的发展。研究表明内源性的AHR激动剂可诱导miR-132/212簇在T细胞的表达，促进Th17细胞的分化可导致EAE疾病发展[30]。因此，作为AHR信号的下游调节信号，抑制miR-132/212簇可阻断Th17细胞生成，可能成为潜在的MS治疗靶点。

2.6其他 Lindberg等[32]比较了365例在复发缓解型多发性硬化(RRMS)患者及健康志愿者外周血CD4+、CD8+T细胞和B细胞中miRNA的表达，其中miR-17-5p、miR-193a和miR-497在MS患者中表达失调，特别是miR-17-5p在MS患者CD4+T细胞中表达上调。miR-17-5p属于 miR-17-92簇，在自身免疫性疾病和淋巴增殖性疾病的小鼠发病中起重要作用。miR-193a可调控caspase级联反应活化[33]，在MS患者CD4+T细胞中比例失调。此外， miR-497在CD4+T细胞和B细胞中表达上调，但在MS患者与对照组的CD8+T细胞中表达下调[34]。

Petrocca等[35]通过测试723名人的miRNA发现，miR-106、miR-25、miR-19a和miR-19b在MS患者及对照组的Treg细胞中显著上调。这些miRNA通过沉默CDKN1A(p21)和BCL2L11(BIM)调节TGF-β信号传导通路。推测维持自身免疫耐受和T淋巴细胞稳态的TGF-β信号转导通路破坏可能是miRNA促进MS发展的方式之一。Guerau-de-Arellano等[36]研究发现，miR-128和miR-27b的表达在初始CD4+T细胞中表达增加，而miR-340在MS患者的记忆性CD4+T细胞中表达增加。研究表明，失调的miRNA通过抑制原癌基因BMI-1和IL-4抑制Th2细胞途径，其过度表达可在MS患者中促进Th1细胞免疫应答和自身免疫的发展。

3miRNA的治疗潜力

目前，有关MS的治疗研究取得新的进展，即以一种特定的miRNA为目标调控致病基因表达。如通过使用和转入修饰的寡核苷酸类似物抑制特定的miRNA可能成为治疗MS最有前景的方法之一。有研究结果显示[37]，锁核酸(locked nucleic acid，LNA)可能胜任这个目的，因为它是一个构象锁定的核苷酸类似物，且能够耐受核酸酶活性。然而，研究者们面临一个重要的问题是如何有效传递这些分子进入生物体，尤其在神经障碍性疾病，递送修饰的寡核苷酸穿过血-脑脊液屏障仍有相对难度。最近一些学者的研究方向已经转向利用小分子药物影响 miRNA的生物合成或功能[38]。检测生物体液(血浆、血清和血液)中异常的miRNA表达水平，可能是MS的新的生物标志物，它可能有助于疾病预后的评估和临床亚型的鉴别，从而有助于治疗决策或者疗效监测。miRNA作为MS新的治疗目标有很大的研究价值和开发空间。

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(本文编辑：时秋宽)

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.01.016

通讯作者：殷旭华，Email：yinxuhua1116@163.com

中图分类号：R744.5+1

文献标识码：A

文章编号：1006-2963 (2016)01-0062-05

(收稿日期：2015-06-16)