上皮组织工程及其在耳鼻咽喉科的应用研究△

张文瑾　孙建军



上皮组织工程及其在耳鼻咽喉科的应用研究△

张文瑾＊孙建军

上皮作为人体的组织器官，具有保护、吸收、分泌、排泄等功能。当发生较大面积的上皮缺损时，通常需要上皮移植(自体或异体)来修复，但存在供区损伤或数量不足的问题。近年，应用组织工程构建上皮修复创面的研究取得了一定的进展。本文综述上皮组织工程所涉及的种子细胞、生物支架、细胞与支架的相互作用以及在耳鼻咽喉外科的应用等相关问题。(中国眼耳鼻喉科杂志，2016，16：365-368)

上皮；组织工程；干细胞；支架材料；耳鼻咽喉科学

皮肤作为人体最大的组织器官，承担维持体内稳态，防止体液、电解质丢失，阻止外界环境有害因素侵入体内的功能。每年有数以百万计的人承受着因火灾、高温、化学物质、紫外线、电磁辐射所致皮肤缺损的痛苦或疾病[1]。较大面积的皮肤缺损通常需要皮肤移植(自体或异体)来修复，但存在供区损伤或皮肤数量不足的问题。近年来使用组织工程皮肤修复创面取得了一定的疗效。本文就上皮组织工程所涉及的种子细胞、生物支架、细胞与支架相互作用以及在耳鼻喉头颈外科的应用等相关问题进行综述。

1　相关种子细胞

迄今，皮肤组织工程研究人员已经成功利用体细胞制备出皮肤类似物，例如Integra、 Apligraf等,它们已成为临床修复应用中非常重要的材料。但上述工程皮肤要求的新生儿包皮上皮细胞和包皮成纤维细胞不易获取，在传代培养中易老化等诸多问题仍难以解决。随着干细胞的发现，具有自我更新、无限增殖分裂、多向分化潜能的特殊细胞为解决上述问题带来了希望。目前用于上皮组织工程的干细胞主要有骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)、脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)以及表皮干细胞。

Meruan等[2]在真皮替代物上培养ASCs，48 h后将复合物移植入大鼠皮肤缺损处，实验侧比较对照侧组织学显示，ASCs显著增加微血管密度和Ⅰ型胶原的合成。 Liu等[3]将BMSCs注射受伤的大鼠体内，对照磷酸盐缓冲液(PBS)组，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)表明， BMSCs在脂多糖(LPS)、白细胞介素1α(IL-1α)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的刺激下能够表达转化生长因子β-1、表皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、角质细胞生长因子、成纤维生长因子和肝细胞生长因子。

尽管BMSCs和ASCs在皮肤培养中显示出巨大的优势，其自分泌的生长因子不仅促进细胞的迁移和增殖[4]，同时促进局部血管的生成，并且有在体外和体内分化为表皮细胞的潜能，即形成皮肤类似物[5-7]；然而，它们可能需要经过复杂的转化才能成为目标细胞。研究者通过化学因子诱导、基因修饰和蛋白质修饰，从而调控信号分子诱导细胞分泌生物活性信号，使其分化为特定的上皮组织。Lu等[8]将包装有基因硬脂酰辅酶A脱氢酶Ⅰ的病毒载体感染BMSCs，完成细胞培养和内皮诱导，1周和2周后荧光定量聚合酶链反应测定SCD1过度表达组中CD31、血管假性血友病因子和血管内皮钙黏蛋白的mRNA数量明显高于空载体组和正常组，表明SCD1的高表达可能会提高诱导的内皮细胞表达。此外，Shokrgozar等[6]已观察确定ASCs在角质细胞生长因子的作用下可以分化为角质细胞。

表皮干细胞或者是干细胞源性表皮有一定优势，它们在特定的环境中可以充分分化为表皮细胞，在较短的时间内有高分化能力。预计在早期分化阶段可能有助于皮肤高质量的愈合和再生[9]。基于上述特点，近年来表皮干细胞迅速成为研究热点。Lough等[10]注射G蛋白偶联受体6(G-protein coupled receptor 6，LGR6)+绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表皮干细胞到小鼠的伤口床，与对照组比较，实验组伤口愈合增强，新生卵泡生长，Wnt信号扩大，血管内皮生长因子、表皮生长因子和血小板衍生生长因子增多，表明LGR6 +GFP表皮干细胞移植可以促进上皮化、毛发生长和血管生成。

2　可行的支架材料

支架材料的作用在于为细胞提供增殖、分化的空间，同时重塑其外形。现常用的支架材料主要分为化学合成的高分子可降解材料和天然可降解高分子材料。

2.1常用合成材料分为聚羟基乙酸、聚乳酸(聚L乳酸和聚D,L乳酸等)。其优势如下：①生物降解的可控性；②具有一定的机械张力；③无细胞毒性。但也有以下缺点：①亲水性差；②降解缓慢,降解时间>2年[11]，且降解时产生CO2导致组织和细胞坏死[12]；③缺乏基底膜和天然的细胞识别位点[13]，从而缺乏生物活性。

2.2常用天然支架材料包括胶原、壳聚糖、脱细胞真皮基质、透明质酸、人脱细胞羊膜、琼脂、角蛋白[12]等。其优势如下：①低的免疫原性；②良好的相容性；③富含活性物质，如生长因子[14]。缺点：①有限的理化可控性；②很难改变降解率；③分离时难以纯化。

为了克服上述材料的不足，更好地发挥它们的优势，主要通过改变支架表层界面的微观结构、组合材料增加亲水性能等措施，模仿细胞外基质的体系结构，提高细胞在支架空间内的黏附性，促进其增殖、迁移和分化的能力。

Ravichandran等[15]比较了ASCs在TCP和2种纳米纤维支架上的增殖情况。第14天和第21天，细胞在纳米纤维组增殖明显优于TCP组。Babaeijandaghi等[16]制造出聚醚砜纳米纤维，平均孔径(492±106) nm，孔隙度为76.27%±1.24%，表面积为39 m2/g。成纤维细胞在聚苯乙烯和聚醚砜纳米纤维支架上生存力没有显著差异，然而聚醚砜纳米纤维较凡士林纱布可以有效加速伤口闭合，10 d后约90%的伤口闭合，12 d完全闭合。实验证明纳米技术可以扩大支架的表面积和孔隙率[12]，在增加气体交换、改善胶原分布、加速表皮再生方面具有巨大潜能。廖玉珍等[17]将透明质酸通过软刻蚀的方法(the method of soft-lithography)在钛金属表面得到轮廓清晰的微米级小尺寸图形，有效地将细胞限制在一定的区域，引导细胞朝一定的方向伸长，细胞骨架排列分布与细胞形态一致。

汤勇等[18]制备的胶原-壳聚糖膜既提高了单一胶原材料的拉伸强度和抗降解能力，又改善了单一壳聚糖材料的吸附力。通过对角蛋白、细胞膜波形蛋白、细胞核增殖抗原和培养上清液羟脯氨酸的测定，证实胶原-壳多糖适合鼓膜角朊细胞和成纤维细胞的生长、增殖，并且成纤维细胞保持好的胶原分泌功能。Ravichandran等[15]也通过在聚乙烯醇中添加明胶来增加支架的亲水性，从而增加细胞的黏附力。Nayak等[12]合成角蛋白/琼脂支架，既弥补了琼脂的低机械能，又提高了角蛋白的保水能力，同时证明C2C12细胞与支架具有很好的相容性。上述实验提示，亲水性强的支架可以提高一些生长因子、细胞的吸附能力，促进细胞的分泌能力。

3　细胞-支架相互作用

黏着斑黏附是细胞与材料接触附着的主要形式，也是细胞与支架的特异性黏附方式。它们通过整合素和细胞-环境之间的介导信号连接细胞外基质和肌动蛋白细胞骨架[19]。Kim等[19]发现细胞的迁移速度在一定范围内随黏附斑的增大而变快，与前面研究者得出的黏着斑大小和细胞迁移速度呈反比关系并不一致。这种结果的差异可能与细胞的种类、培养因子的种类和浓度以及细胞的生长状态不同有关。

细胞与支架的另一种方式为非特异性黏附，例如范德华力、离子力、静电斥力等物理连接力。细胞通过感受这些物理力的刺激，并对其做出反应，将物理机械信号转化为化学信号向细胞内传递，对细胞的黏附、迁移、增殖、分化产生重要影响。Chen等[1]通过在纳米纤维上增加氨基基团，从而增加其ζ电位。接种培养成纤维细胞观察发现，支架材料的正ζ电位是阴离子细胞黏附所必需的，从而有利于细胞黏附。

4　在耳鼻咽喉科的应用

在耳鼻喉头颈外科领域，组织工程被广泛地应用在气管黏膜、鼓膜再生和乳突气房表面皮肤的再生。气管内壁覆有黏膜，其与皮肤的复层扁平上皮不同，为假复层柱状纤毛上皮，具有呼吸调节、清洁、免疫等生理功能。当其缺损或切除长度在成人达1/2、儿童达1/3时，其重建和功能恢复几乎不可能[20]。近年来，组织工程化材料为这些问题提供了有效的解决方案。Shin等[21]研究了组织工程支架(兔BMSCs +猪软骨粉支架)修复6只兔气管缺损的情况。内镜观察呼吸道上皮完全覆盖再生气管，重建区没有狭窄，再生表皮纤毛运动频率与正常黏膜无显著差异。然而，较多研究者更希望利用资源丰富的干细胞和类气管结构的脱细胞气管支架构建工程化气管。Gray等[22]将组织工程化气管(自体羊膜间充质干细胞+异种脱细胞气管支架)移植于胎儿羔羊，尽管术后所有气管均存在狭窄，但与单纯脱细胞组比较，工程化结构表现出完全的上皮化。在移植物中可以检测供体细胞表现为假复层柱状上皮。Batioglu-Karaaltin 等[23]使用组织工程气管(兔ASCs+兔脱细胞气管基质)修复兔气管缺损。脱细胞组因吻合口区分离、气道阻塞和感染等原因，仅存活(17±2)d。而实验组动物分别于30、60、90 d处死，组织学分析发现，组织工程气管已整合到气管侧，增加了血管化。在纤毛上皮细胞中，上皮细胞下和整合的新气管中均观察到间充质干细胞。Gonfiotti等[24]首次在临床使用组织工程气管(自体表皮细胞和间充质干细胞来源的软骨细胞+人脱细胞基质)为1例30岁末端左主支气管软化的患者进行移植。术后1年，气管吻合口附近的自体气管出现渐进性瘢痕性狭窄，而组织工程气管开放，血管化和完全再细胞化，拥有呼吸上皮，具有正常的纤毛功能和黏液清除功能。

鼓膜穿孔是耳科常见疾病，临床通过获取周围正常组织来修复穿孔，尽管效果较好，但取材损伤无法避免。此外，少数失败病例再次手术时面临组织来源受限问题。因此将组织工程技术用于此领域，极具挑战意义，具有广阔的应用前景。

鼓膜表皮细胞层的潜在祖细胞和干细胞可能在鼓膜愈合中发挥着重要的调节作用[25]；许多研究已经评估了生物分子和生长因子，如表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在鼓膜的再生中产生显著作用。目前，更多的鼓膜工程新策略则涉及生物工程支架材料，它们表现出良好的生物相容性和更高的穿孔愈合率。Hakuba等[26]设计了缓释碱性成纤维生长因子的明胶水凝胶修复豚鼠鼓膜，单纯明胶组仅3只耳鼓膜穿孔获得菲薄闭合，实验组所有8只耳鼓膜穿孔均完全闭合。组织学观察，除了黏膜和表皮的再生，中间纤维层也出现了再生。Qin等[27]用脱细胞真皮基质修补穿孔的豚鼠鼓膜，对比空白对照组，愈合效果明显提升。术后8周，实验组鼓膜大量的上皮细胞和扁平细胞附着到纤维层的两侧，与正常的结构类似。Shen等[28]探究了丝素材料和猪源性细胞胶原Ⅰ/Ⅲ支架作为材料修补穿孔，2种材料在大鼠体内有很好的相容性，产生很小的中耳组织反应和炎症，鼓膜无明显的纤维化和骨生成。

开放性乳突根治术后需要定期清理术腔和换药，直到术腔上皮化，达到干耳。一般上皮化需2～3个月，如果上皮化时间过长或未完全上皮化可直接影响手术效果且降低患者生活质量。黄秀娟等[29]和杨柳等[30]先后使用异种脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)进行术腔骨壁的覆盖。术后实验组术腔完全上皮化时间分别为4.2周、(54.5±12.1)d，对照组为11.5周、(70.1±14.3)d，在2次实验中组间差异均具有统计学意义，证明ADM应用于乳突根治术中，可缩短术后上皮化时间。作者用ASCs与脱细胞基质共培养，获得ASCs膜片-脱细胞基质复合物，分别修复兔耳廓腹侧皮肤和外耳道皮肤。与对照组(单纯支架组和空白组)比较，实验组皮肤愈合明显增快。组织学观察实验组新生皮肤更加接近正常结构，Western 印迹也发现实验组能分泌更多的生长因子促进伤口愈合。

5　问题与展望

迄今皮肤组织工程研究中对干细胞的选择尚有较多问题：干细胞的鉴定，细胞诱导分化机制，如何形成稳定的表皮、真皮间的连接结构等。这方面必须通过对细胞的许多不同特征进行研究(如体内或体外的分裂行为、形态学及蛋白质的表达、基因表现鉴定和分离干细胞等)，深入了解细胞在体内的分化机制和信号传导通路以及表皮真皮间的超微结构等，从而有望得到理想的组织工程皮肤。研究发现，大多数单一支架材料难以满足组织工程皮肤构建的要求，需要通过化学和物理修饰，调整材料关键参数来重新整合支架。到目前为止，用支架、细胞因子、温度和湿度等条件创造一个近似生理的微环境促进细胞朝着目标细胞分化生长尚在探索中。近年发展的原位组织工程技术, 或许有助于解决复杂的局部调控机制所带来的问题。已有实验[31]证明，蛋白水解抗性血管生成肽纳米纤维可以提供一个稳定的原位组织工程临时基质，在减轻创伤面炎症、增强新生血管形成和改善伤口愈合方面可以提供有意义的实验依据。

[1]Chen H, Huang J, Yu J, et al. Electrospun chitosan-graft-poly (ε-caprolactone)/poly (ε-caprolactone) cationic nanofibrous mats as potential scaffolds for skin tissue engineering [J]. Int J Biol Macromol, 2011, 48(1):13-9.

[2]Meruan MA, Rojas M, Marcelain K. The use of adipose tissue-derived stem cells within a dermal substitute improves skin regeneration by increasing neoangiogenesis and collagen synthesis [J]. Plast Reconstr Surg, 2012, 130(1): 53-63.

[3]Liu Y, Dulchavsky DS, Gao X, et al. Wound repair by bone marrow stromal cells through growth factor production [J]. J Surg Res, 2006, 136(2): 336-341.

[4]雷菲,孙建军,刘阳, 等. 大鼠体外培养脂肪干细胞对鼓膜成纤维细胞的影响 [J]. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志. 2010, 45(7): 587-591.

[5]Gu J, Liu N, Yang X, et al. Adiposed-derived stem cells seeded on PLCL/P123 eletrospun nanofibrous scaffold enhance wound healing [J]. Biomed Mater, 2014，9(3):035012.

[6]Shokrgozar MA, Fattahi M, Bonakdar S, et al. Healing potential of mesenchymal stem cells cultured on a collagen-based scaffold for skin regeneration [J]. Iran Biomed J, 2012，16(2): 68-76.

[7]耿献辉,余春艳,邓志宏,等. 骨髓间充质干细胞复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤 [J]. 中国美容医学, 2007，16(4): 443-446

[8]Lu Y, Zhou Z, Tao J, et al. Overexpression of stearoyl-CoA desaturase 1 in bone marrow mesenchymal stem cells enhance the expression of induced endothelial cells [J]. Lipids Health Dis, 2014, 13: 53.

[9]Cerqueira MT, Marques AP, Reis RL. Using stem cells in skin regeneration: possibilities and reality [J]. Stem Cell Dev, 2012, 21(8): 1201-1214.

[10]Lough DM, Yang M, Blum A, et al. Transplantation of the LGR6+ epithelial stem cell into full-thickness cutaneous wounds results in enhanced healing, nascent hair follicle development, and augmentation of angiogenic analytes [J]. Plast Reconstr Surg, 2014. 133(3): 579-590.

[11]El-Ghalbzouri A, Lamme EN, Van Blitterswijk C, et al. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering [J]. Biomaterials, 2004, 25(15): 2987-2996.

[12]Nayak KK, Gupta P.Invitrobiocompatibility study of keratin/agar scaffold for tissue engineering [J]. Int J Biol Macromol, 2015, 81: 1-10.

[13]Tjin MS, Chua AW, Ma DR, et al. Human epidermal keratinocyte cell response on integrin-specific artificial extracellular matrix proteins [J]. Macromol Biosci,2014, 14(8): 1125-1134.

[14]Ji SZ, Xiao SC, Luo PF, et al. An epidermal stem cells niche microenvironment created by engineered human amniotic membrane [J]. Biomaterials, 2011, 32(31): 7801-7811.

[15]Ravichandran R, Venugopal JR, Sundarrajan S, et al. Click chemistry approach for fabricating PVA/gelatin nanofibers for the differentiation of ADSCs to keratinocytes [J]. J Mater Sci Mater Med, 2013，24(12): 2863-2871.

[16]Babaeijandaghi F, Shabani I, Seyedjafari E, et al. Accelerated epidermal regeneration and improved dermal reconstruction achieved by polyethersulfone nanofibers [J]. Tissue Eng Part A, 2010, 16(11): 3527-3536.

[17]廖玉珍, 杨苹, 王进, 等. 内皮细胞在钛金属表面透明质酸微图形上的黏附行为[J]. 功能材料, 2010, 41(10): 1807-1809.

[18]汤勇, 孙建军, 雷菲. 胶原-壳聚糖膜在组织工程化鼓膜中的应用[J]. 听力学及言语疾病杂志, 2009, 17(6): 563-566.

[19]Kim DH, Wirtz D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration [J]. FASEB J, 2013, 27(4): 1351-1361.

[20]Grillo HC. Tracheal replacement: a critical review [J]. Ann Thorac Surg, 2002, 73(6): 1995-2004.

[21]Shin YS, Choi JW, Park JK, et al. Tissue-engineered tracheal reconstruction using mesenchymal stem cells seeded on a porcine cartilage powder scaffold [J]. Ann Biomed Eng, 2015, 43(4): 1003-1013.

[22]Gray FL, Turner CG, Ahmed A, et al. Prenatal tracheal reconstruction with a hybrid amniotic mesenchymal stem cells-engineered construct derived from decellularized airway [J]. J Pediatr Surg, 2012, 47(6): 1072-1079.

[23]Batioglu-Karaaltin A, Karaaltin MV, Ovali E, et al. In vivo tissue-engineered allogenic trachea transplantation in rabbits: a preliminary report [J]. Stem Cell Rev，2015, 11(2): 347-356.

[24]Gonfiotti A, Jaus M O, Barale D, et al. The first tissue-engineered airway transplantation: 5-year follow-up results [J]. Lancet，2014, 383(9913):238-244.

[25]Kim SW, Kim J, Seonwoo H, et al. Latent progenitor cells as potential regulators for tympanic membrane regeneration [J]. Sci Rep, 2015,5: 11542.

[26]Hakuba N, Tabata Y, Hato N, et al. Gelatin hydrogel with basic fibroblast growth factor for tympanic membrane regeneration [J]. Oto Neurotol, 2014, 35(3): 540-544.

[27]Qin H, Sun J, Li X, et al. An experimental study on tympanic membrane reconstruction with acellular dermal matrix [J]. Acta Otolaryngol, 2012, 132(12):1266-1270.

[28]Shen Y, Redmond SL, Papadimitriou JM, et al. The biocompatibility of silk fibroin and acellular collagen scaffolds for tissue engineering in the ear [J]. Biomed Mater，2014，9(1)：015015.

[29]黄秀娟, 朱富高, 孙美红, 等. 异种(牛)脱细胞真皮基质在开放性乳突腔根治术中应用的疗效观察[J]. 中华耳科学杂志, 2013, 11(1)：85-87.

[30]杨柳, 赵宇. 异种(牛)脱细胞真皮基质在乳突根治术中的应用[J]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2014，9(1): 69-72.

[31]Balaji S, Vaikunth SS, Lang SA, et al. Tissue-engineered provisional matrix as a novel approach to enhance diabetic wound healing [J]. Wound Repair Regen, 2012, 20(1):15-27.

(本文编辑杨美琴)

Epithelial tissue engineering and its application in otolaryngology

ZHANGWen-jin＊,SUNJian-jun.

DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery,NavyGeneralHospitalofPublicLiberationArmy,Beijing100048,China

SUN Jian-jun, Email: jjsun85@sina.com

As the body tissue, epithelium has the functions of protection, absorption，secretion and excretion. When people suffer from large epithelium defects, epithelium grafts (autografts or allografts) are usually used to treat wounds. However, the epithelial substitutes mentioned above have some clinical problems such as donor site damage or lack of the material. Recently, tissue engineering technologies for epithelium has made some progress. In this paper, the epithelial tissue engineering involving the seed cell, biological scaffold, the interaction between cells and scaffolds, and the application in otolaryngology were reviewed. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:365-368)

Epithelium; Tissue engineering; Stem cell; Scaffold material; Otolaryngology

国家自然科学基金(81170904)

中国解放军海军总医院全军耳鼻咽喉-头颈外科中心北京100048；＊安徽医科大学研究生学院合肥230032

孙建军(Email: jjsun85@sina.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.05.021

2016-01-11)