心肌损伤标志物的急诊检测和miRNAs研究进展

李春雨 姜婷 王魏魏 陈君 何琪芳 张劲松 范勇 齐炼文 李萍 曹克将 钱玲梅 陈彦，4

许多心脏疾病的发病早期，在尚未出现临床症状时就已经发生心肌损伤的病理变化。心肌损伤程度对心脏疾病的诊断及预后判断有较大影响。约25%的急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者在发病时不会表现出明显的典型症状和体征，约50%以上的患者心电图可无典型变化。相对而言，心肌标志物实验室检查简便易行，因此对心肌损伤标志物的研究具有重要的意义[1]。

心肌细胞受到损伤后，因细胞膜的完整性和通透性改变导致细胞内大分子物质逸出，这些在外周循环中能被检测出的物质称为心肌损伤标志物。最早追溯到1954年，Ladue[2]首先发现AMI患者血清天冬氨酸氨基转移酶/谷氨酸草酰乙酸转氨酶(AST/GOT)水平升高，成为AMI的第一个血清酶标志物。经过半个多世纪对心肌损伤标志物种类及检测方法的研究，已不断成熟，对降低心肌受损导致各种心脏疾病的病死率和预后评估具有重要作用。好的标志物具有以下特点：(1)易于获取，最好通过无创手段获取。(2)敏感性高、组织特异性强。(3)分析检测方法便捷、费用合理和诊断窗口期短。(4)实现早期诊断、危险分层和监测病情进展[3]。

本文将从以下3方面进行概述：(1)目前临床广泛应用的心肌标志物：包括肌红蛋白、肌酸激酶、肌钙蛋白及高敏肌钙蛋白。(2)其他生物标志物：包括C反应蛋白、钠尿肽、心肌脂肪酸结合蛋白、和肽素等。(3)新型生物标志物：微小RNA的临床应用进展

一、临床广泛应用的心肌标志物

1.肌红蛋白(myoglobin,Mb)：Mb具有早期诊断急性心肌梗死的价值，阴性预测值较高，但特异性较低。Mb是一种氧结合血红素蛋白，主要分布在心肌和骨骼肌，因其分子量小，心肌细胞损伤后最先释放入血，是心肌损伤后最早上升的标志物，也是第一个用于诊断心肌损伤的非酶类蛋白[4]。发病后1～2 h就异常增高，4～8 h达到峰值，24 h逐渐下降，具有高度的敏感性，在AMI发病4 h阳性检出率高达98%。但Mb并非心肌损伤的特异性标志物，易受到肾脏和骨骼肌疾病的干扰，作为早期心肌梗死标志物，有很高的阴性预测价值。Mb阴性有助于排除ACS早期诊断，同时也是冠脉再通后再发梗阻敏感且快速的标志物。若为阳性，则需排除其他情况。若重新升高，应考虑再梗死[5]。对于未确诊的AMI患者，每隔2 h测定一次Mb阴性则可以排除AMI诊断[6]。症状开始24 h后做检查，肌红蛋白应该在正常范围，并指出该指标一般和其他组织特异性强的指标联合使用

2.肌酸激酶(creatine kinase，CK)及其同工酶(MB isoenzyme,CK-MB)：肌酸激酶共有3种，即CK-MB、CK-BB和CK-MM,其中 CK-MB主要分布于心肌细胞，在AMI 4 h开始升高，16～24 h达高峰，3～4 d恢复正常。CK-MB进入血中经羟肽酶分解为两个亚型，即CK-MB1和CK-MB2，是诊断AMI最有价值的酶学生化指标[7]。以CK-MB1>3 mg/L，CK-MB1：CK-MB2>1.5作为诊断标准，其敏感性比单纯CK-MB高；而采用质量分析方法测定其蛋白浓度，具有高度的敏感性和准确性，测定时间短，适合于自动分析已被广泛认可[8]。

但与蛋白肽类标志物相比，敏感度不高、组织特异性差，其自身优势在于[9]：AMI后CK-MB持续高水平，提示心肌坏死仍在继续；由于CK-MB半衰期短，他对有无再梗死或梗死区域有无扩大更敏感，由于CK-MB半衰期短，可以作为判断有无再梗死或梗死区域有无扩大更敏感的标志物；而cTnI在血中保持高水平数天，因此在判断有无再梗死或梗死区域有无扩大方面弱于CK-MB或Mb。CK-MB是否提前有助于判断溶栓是否成功，因此CK-MB曾一度被认为是诊断AMI的“金标准”。AMI患者CK-MB质量和活性测定的动态观察结果显示，CK-MB质量升高较CK-MB活性升高明显，在AMI的早期诊断上优于CK-MB活性[10]。

3.肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)和高敏肌钙蛋白(high sensitivity cardiac troponin,hs-cTn):肌钙蛋白分cTnI、 cTnT和cTnC3个亚型，是钙离子受体蛋白，通常在发病后4～6 h出现，18～24 h达到高峰，可持续存在5～14 d，因其灵敏度高、特异性强、持续时间长，被临床广泛使用[11]。根据ESC对标志物的推荐，肌钙蛋白接近第99百分位上限，2 h 内增加超过50%，将会提高AMI的诊断准确性[12]。研究表明，肌钙蛋白并不是早期诊断AMI的理想标志物：上升缓慢、达峰时间较久，不能诊断再发梗死因为梗死2周后肌钙蛋白浓度仍然较高，为了能够早期排除AMI，高敏肌钙蛋白应运而生，灵敏度大大提升[13]。

近年来国内外医院使用cTnI、Myo、CK-MB作为诊断AMI的新指标，尤其是cTnI已取代CK-MB作为诊断心肌损伤新的“金标准”，是目前诊断心肌损伤较好的确定标志物。然而，一旦AMI患者在cTnI持续阳性期间再次发生梗死，此时CK-MB就具有更好的敏感性。因此，cTnI不能完全取代CK-MB[8]。cTnI的特异性优于cTnT和cTnC，由于在其N末端多出31个氨基酸残基有特异性抗原，故其是心肌损伤标志物中特异性最高的。在变异性心绞痛患者体内可检测到cTnI升高，而CK-MB没有升高，说明cTnI可以检测到微小的心肌损伤[14]。

临床表现胸痛但心电图正常的患者中：cTn水平升高者，冠脉疾病占90%；cTn水平正常者，冠脉疾病者占23%(P<0.001)，当心肌损伤时，cTn释放入血的百分率比CK-MB显著升高，在血液中维持时间较长，因其持续升高的窗口期，提高了检测敏感性[15]。cTn在临床上主要用于心肌缺血损伤的诊断、危险评估和预后判断；MI后溶栓效果判定；心肌炎、左心衰竭，以及药物的临床疗效观察等。近几年来，通过检测方法的改进，已经能实现对低浓度肌钙蛋白进行精确检测，称为超敏感肌钙蛋白检测法，其检测下限降低，敏感性明显提高。该方法对AMI及时诊断的敏感性从70%上升至90%，对于表现出ACS症状的患者，肌钙蛋白阳性率较以前的检测方法增加约60%[12]。

2011年，ESC和ACC联合发表非ST段抬高型冠脉综合征指南中将高敏Tn作为急性冠脉综合征的诊断和危险分层的主要依据。也有研究结果显示超敏感肌钙蛋白T(hs-cTnT)表达水平≥3 μg/L和≥14 μg/L对鉴别心肌损伤和AMI有重要意义，对于预测心肌损伤有重要价值[16]。另外一项大型研究利用高敏肌钙蛋白和目前诊断金标准肌钙蛋白分析其作用效能差异，结果显示,在肌钙蛋白阴性的患者中，高敏肌钙蛋白的诊断敏感性和特异性为82%和68%，ROC曲线下面积为0.81，表现了高敏肌钙蛋白能够增加非ST段心梗的早期检出率[17]。而在另一项研究中，在3 h内测定的高敏肌钙蛋白阳性预测值96%，阴性预测值100%，特异度在90%～94%，支持在早期排除AMI的价值[18]。

当然，肌钙蛋白也并非只要AMI时才升高，例如脓毒症、心衰、肾衰、肺栓塞和心包炎等[19-20]。当没有ACS的临床证据，但肌钙蛋白却升高的患者，应考虑其他心肌损伤疾病。如创伤性心脏病，充血性心衰，高血压等[21]。

二、其他生物标志物

1.B型钠尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)：在心室负荷增加或心室增大时，BNP合成分泌并释放入血控制体液和电解质的动态平衡。BNP主要用于诊断心力衰竭、监测病程进展、对疗效和预后进行评估。AMI患者在治疗后对其心室功能的恢复状况进行评估，当治疗有效时，BNP水平明显下降，BNP水平的持续升高或持续不降低，通常提示患者的心力衰竭未得到纠正或进一步加重[22]。同时BNP和NT-proBNP在ACS的诊断和早期危险分层也有重要意义[23]。

研究表明，以BNP在血中浓度超过100 pg/mL为界，心衰的诊断敏感度达90%以上，特异度达84%，因此对于心肌损伤的阳性阈值也可选择BNP 100 pg/mL[24]。同时，有研究报导在不稳定心绞痛患者中， BNP水平和患者的死亡率密切相关[25]。

2.C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)：CRP最早是在急性肺炎患者外周血中发现的一种急性时相反应蛋白,属非特异性的炎症标志物,参与动脉粥样硬化的病程发展，包括从单核细胞的募集到最后斑块破裂[26]。超敏C反应蛋白(high sensitive C-reactive protein，hs-CRP)和CRP是同一种物质但临床意义却不同：CRP反应机体的炎症和创伤，而hs-CRP 更多被用来预测粥样硬化性心脑血管事件，但其升高的程度与冠脉狭窄程度及心肌损伤范围无关。由于本身介导动脉粥样斑块形成，其升高是AMI的独立高危因素和早期诊断的辅助指标，可用于心血管疾病危险程度的评估。在除外其他因素引起hs-CRP水平增高情况下，hs-CRP可反映冠状动脉炎症情况，但其特异度比较差，因此不能作为诊断的惟一依据[27]。

心肌坏死后，由于炎症反应CRP上升，也有报导CRP和梗死的大小和程度相关，基线CRP浓度可以预测心血管事件发生[28-29]，但最佳检测时间还不清楚。NACB指南指出不应把CRP作为期初评估，并且把CRP作为ⅡA级推荐作为ACS的早期危险分层[13]。

3.心肌型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid binding protein，H-FABP)：H-FABP大量存在于心肌组织中，比骨骼肌中高10倍，因其可溶、分子量小、心肌特异性强和经肾脏清除快等优点，主要作用是调节细胞脂肪酸代谢和维持脂质稳态，参与细胞信号转导，心肌缺血时能保护心肌，对于早期ACS特别是3 h内的AMI诊断有重要意义[30]。

对于AMI早期的诊断价值，在研究[31]提到其血中浓度在胸痛发生后1～3 h升高，6～8 h达峰，24～30 h恢复正常，在心肌损伤后释放入血的速率超过任何已知心肌酶。研究[32]得出结论：H-FABP对AMI初期诊断比Mb、cTnT及CK-MB有更高的敏感性，是早期诊断的重要标志物，但4种指标的诊断特异性无明显差异。Fiqiel等发现[30]，入院时H-FABP明显优于其他心肌损伤标记物，其敏感度为94.7%，特异度为100%，阳性预测值和阴性预测值分别为100%和93.4%，可作为早期诊断非ST段抬高型心梗的较好标志物，排除心肌坏死，但同时也提到H-FABP不宜单独用来排除AMI。

4.和肽素(copeptin)：和肽素是和血管加压素等量产生和分泌的物质，半衰期较长，更容易检测[33]。在一项前瞻性研究结果显示AMI患者和肽素水平在早期达到高峰，维持3～5 d，且在后期的随访中发现和肽素的浓度和心衰等恶性心血管事件相关[34]。在和肌钙蛋白比较中，Reichlin等[35]发现，联合检测和肽素和肌钙蛋白能够提高诊断准确性(联合检测ROC曲线下面积为0.97，单独检测肌钙蛋白为0.86)。

三、新型生物标志物微小RNA(miRNA)

目前，临床上使用的生物标志物大多是蛋白质及多肽类，近些年来，分子遗传水平的仍在研究中[36]。而miRNAs由于其具有组织和细胞特异性，参与多种病理生理过程，有望成为一种新型生物标志物[37]。

尽管miRNA的功能尚未完全阐明，但目前己明确某些miRNA有一定的组织特异性并参与斑块稳定性的调节，比如心肌肌组织富含的miR-133a，miR-499，miR-208a等[38]。miRNA的如下特性使其具备了作为生物标志物应用于临床诊断的潜力：(1)具有极强的稳定性。(2)稳定存在于体液循环。(3)表达的组织特异性。(4)miRNA反应更为迅速。(5)灵敏特异的miRNA检测手段40。另外miRNA不但可以抵抗酶的消化，而且耐酸耐碱，更不受温度变化及放置时间的影响比蛋白更适合作为标志物[39]。

关于miRNA作为检测急性心肌梗死的生物标记物，目前研究较多的是miRNA-499、miRNA-1、miRNA-133和miRNA-208[40-41]。Ai等[42]则针对心肌组织高表达，同时在心肌缺血后会表达增高的miR-1，对急性心梗人群和非心梗人群血浆中的含量进行了研究，他们发现miR-1在急性心梗人群中的含量要高于非心梗人群，其含量和心电图QRS 波的宽度存在正相关性，提示血浆中心脏高表达的miRNA可作为急性心梗诊断新的标志物，可能对急性心梗的预后判断具有一定的价值。Wang等[43]从理想的心肌标志物的特征出发，筛选了心脏特异高表达而血浆中缺乏或含量微弱的miRNA作为候选标志物，包括miR-208a、-499、-133a 和-1，利用开胸结扎前降支的方法制备了急性心梗动物模型，发现这4个miRNA在冠脉结扎1 h 后均能检测到明显的增加，在6～12 h血浆中含量达到高峰，24 h的时候显著下降，结合miRNA的表达谱以及单纯开胸不结扎冠脉的假手术组血浆中miR-133a、-1和-499 也出现不同程度增加的现象，他们认为心脏特异的miR-208a是一个较好的候选标志物。随后的研究发现，血浆中这4个miRNA的平均水平在急性心梗人群中显著高于非心梗人群，这种差异能有效地区分心梗人群(ROC 分析曲线下面积均在0.8 以上)；尤其是miR-208a，在非心梗人群中检测不到(PCR 结果CT 值>40)，而在90.9%(30/33)的心梗人群中能检测到显著增高。进一步对急性心梗人群按照胸痛时间进行亚组分析时发现，在胸痛4 h以内miR-208a对急性心梗的检出率要高于肌钙蛋白，提示血浆miRNA 很可能作为急性心梗新的诊断标志物。新近研究显示，miR-499作为AMI标志物的灵敏度及特异度较miR-208、miR-1和miR-133a高；与单独使用cTnT和miR-499相比，两者结合能提高AMI诊断的敏感性和特异性[45]。但miRNAs也并非只在急性心肌梗死中才特异性表达，一项研究指出，miRNAs在不稳定型心绞痛和心肌梗死患者的血浆中有重叠，但如何区分，尚未具体说明[46]。

通过以上叙述，我们可以看到，miRNAs具有在外周血中出现较早且稳定、准确率高、结构简单等优势，尤其是和目前高敏肌钙蛋白的联合应用，也许可以提高检出率和准确率。然而在推广应用之前，还有许多需要解决的问题: 目前所报道的研究纳入样本量都较小，需要进一步的大样本数据来验证，包括目前的从AMI的发病到外周血中miRNAs可检测到的最短时间、参考区间及出现的miRNAs种类及顺序、联合检测的方案等。

四、总结

心肌损伤过程中各种生化标志物的结构和诊断的特异性及敏感性各具特点，对早期诊断心肌损伤，降低其发病率和病死率起着重要的作用。随着医学的不断发展和进步，越来越多的心肌损伤标志物正在被发现，其特异性和敏感性也在不断提高。由于在血中出现、达峰、维持及消退的时间不同，心肌损伤标志物的联合检测在心血管疾病患者的预测、筛选、诊断、治疗和预后评估中定会占据重要地位。目前肌钙蛋白(cTn)及其新一代超敏肌钙蛋白(hs—cTn)是诊断心肌梗死的金标准，和肌酸激酶(CK-MB)、肌红蛋白的联合检测可以实现早期诊断、提高准确性和监测病情进展。但当临床检测到这些标志物时，心肌细胞可能已经发生了不可逆的损伤，miRNA等新型生物标志物的灵敏度和特异度不亚于肌钙蛋白，作为一类参与转录后水平调节的非编码小分子RNA，其中miRNA-1、miRNA-133、miRNA-208、miRNA-499研究的最多，这些miRNAs在心肌梗死早期(<3 h)甚至比肌钙蛋白更敏感，达峰时间更早，有望成为心肌损伤，尤其是急性心肌梗死新的诊断标志物和治疗靶点。

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