急性低血糖大鼠血清FT3、FT4、TSH水平及下丘脑组织TRH表达变化

屈丹，姜雅秋( 中国医科大学附属第一医院内分泌与代谢病科，内分泌研究所，沈阳000;2本溪市中心医院内分泌科)

急性低血糖大鼠血清FT3、FT4、TSH水平及下丘脑组织TRH表达变化

屈丹1，2，姜雅秋1
( 1中国医科大学附属第一医院内分泌与代谢病科，内分泌研究所，沈阳110001;2本溪市中心医院内分泌科)

摘要:目的观察急性低血糖大鼠血清游离三碘甲状腺原氨酸( FT3)、游离甲状腺素( FT4)、促甲状腺激素( TSH)水平及下丘脑组织促甲状腺激素释放激素( TRH)表达的变化。方法Wistar大鼠21只，根据血糖水平分为正常血糖组、轻度低血糖组、重度低血糖组3组，每组7只，后两组腹腔注射短效胰岛素诱导急性低血糖，轻度低血糖组血糖2.0～2.64 mmol/L，重度低血糖组血糖＜2.0 mmol/L。化学发光免疫法检测各组大鼠血清FT3、FT4、TSH，Western blotting法、实时荧光定量PCR法分别检测各组大鼠下丘脑组织中的TRH蛋白及mRNA。结果正常血糖组、轻度低血糖组、重度低血糖组FT3分别为( 5.05±1.40)、( 4.82±1.22)、( 4.92±1.08) pmol/L，FT4分别为( 2.45±0.26)、( 2.19±0.11)、( 2.30±0.21) pmol/L，TSH分别为( 0.16±0.10)、( 0.05±0.03)、( 0.04±0.04)μIU/mL，轻度低血糖组、重度低血糖组分别与正常血糖组FT4、TSH比较，P均＜0.05。正常血糖组、轻度低血糖组、重度低血糖组TRH蛋白分别为0.66±0.01、0.34±0.01、0.52± 0.07，TRH mRNA分别为1.44±0.10、0.54±0.04、2.42±0.97，轻度低血糖组、重度低血糖组分别与正常血糖组比较，轻度低血糖组与重度低血糖组比较，P均＜0.05。结论急性低血糖大鼠血清FT4、TSH水平降低，FT3不变，下丘脑组织中TRH蛋白表达降低，TRH mRNA表达先降低后升高。

关键词:应激反应;低血糖;游离三碘甲状腺原氨酸;游离甲状腺素;促甲状腺激素;促甲状腺激素释放激素

应激是一种机体多系统共同参与的全身性适应反应，在应激原的刺激下，机体过度分泌或抑制相关应激激素。在创伤应激相关激素中最有特异性的指标为皮质醇和甲状腺激素，两者具有对应激后机体的保护作用。急性低血糖作为一种急性应激状态，在低血糖发生时，下丘脑的“糖感受器”将信息迅速传递到相关神经元，引起下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素( CRH)细胞兴奋，同时表达促甲状腺激素释放激素( TRH)。本研究观察了急性低血糖大鼠血清游离三碘甲状腺原氨酸( FT3)、游离甲状腺素( FT4)、促甲状腺激素( TSH)水平及下丘脑组织TRH表达的变化。

1　材料与方法

1.1动物与试剂3～8周龄SPF级Wistar雄性大鼠21只，体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物中心。FT3、FT4、TSH采用西门子DPC Immulite 2000型自动发光免疫分析仪检测，TRIzol购自大连宝生物公司，逆转录试剂盒购自大连宝生物公司，实时荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司，TRH及β-actin引物购自大连宝生物公司，TRH一抗购自北京博奥森生物有限公司。

1.2实验动物分组及处理根据血糖水平分为正常血糖［1］组、轻度低血糖组、重度低血糖组3组，每组7只。后两组采用胰岛素腹腔注射诱导大鼠低血糖的方法［2］，腹腔注射短效胰岛素(生物合成人胰岛素，诺和诺德公司，50 U/kg)。以微型血糖仪(德国罗康全)断尾法测量血糖，并记录所有大鼠腹腔注射胰岛素后每隔30 min的血糖值，直至达到目标血糖。轻度低血糖组血糖2.0～2.64 mmol/L，大鼠兴奋、身体发抖、四处觅食;重度低血糖组血糖＜2.0 mmol/L，大鼠神志恍惚甚至全身抽搐。大鼠称体质量，10%水合氯醛腹腔麻醉后，上腹正中切口，游离肋骨，心脏采血，3 000 r/min离心10 min，分离血浆，存入Eppendorf管中，－80℃冰箱中保存。大鼠经心脏采血后，断头，3 min内取脑，分离脑组织后迅速置于－40℃干冰异戊烷中30 s，快速冷冻脑组织，后于－80℃冰箱冻存。

1.3各组大鼠血清FT3、FT4、TSH检测采用化学发光免疫法，按照西门子DPC Immulite 2000型自动发光免疫分析仪标准操作规程操作。

1.4各组大鼠下丘脑组织TRH蛋白检测采用Western blotting法。组织裂解液裂解下丘脑组织，

12 000 r/min离心5 min，取上清，测定总蛋白含量。已溶解于加样缓冲液的总蛋白质经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，100 V电泳转移至硝酸纤维膜上，脱脂奶粉封闭液封闭2 h，用1∶100稀释TRH抗体(兔抗鼠多克隆抗体，北京博奥森公司)进行Western蛋白印迹杂交，40℃孵育过夜。1∶400稀释的二抗孵育2 h，采用DAB显色试剂盒显影并检测。以β-actin作为内对照。

1.5各组大鼠下丘脑组织TRH mRNA检测采用实时荧光定量PCR法。按照Paxinos-Watson的大鼠脑立体定位图谱，取下丘脑组织50～100 mg，用TRIzol法提取总RNA，取1 μg总RNA用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒进行逆转录反应得到cDNA，再用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。GLP-1R上游引物: 5'-CGACCCTGGATTCGGGAGTA-3'，下游引物: 5'-AGGCGCAGGATTCAGGGATA-3'，产物长度145 bp; GAPDH的上游引物: 5'-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，下游引物: 5'-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3'，产物长度123 bp，反应体系25 μL，逆转录反应条件: 37℃15 min，85℃5 s; PCR反应条件: 95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次; PCR反应结束后，分析DNA扩增曲线，使用专用数据处理软件获取数据，以2－ΔΔCt代表目的基因mRNA的相对表达量。

1.6统计学方法采用SPSS18.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较用Cruskal Wallis分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

各组大鼠血清FT3、FT4、TSH水平比较见表1。各组大鼠下丘脑组织TRH蛋白、mRNA表达比较见表2。

表1　各组大鼠血清FT3、FT4、TSH水平比较(±s)

表1　各组大鼠血清FT3、FT4、TSH水平比较(±s)

注:与正常血糖组比较，ΔP＜0.05。

组别　FT3( pmol/L)　 FT4( pmol/L)　 TSH(μIU/mL)正常血糖组5.05±1.40　 2.45±0.26　 0.16±0.10轻度低血糖组　4.82±1.22　 2.19±0.11Δ　0.05±0.03Δ重度低血糖组　4.92±1.08　 2.30±0.21Δ　0.04±0.04Δ

表2　各组大鼠下丘脑组织TRH蛋白、mRNA表达比较(±s)

表2　各组大鼠下丘脑组织TRH蛋白、mRNA表达比较(±s)

注:与正常血糖组比较，ΔP＜0.05;与轻度低血糖组比较，▲P＜0.05。

组别　TRH蛋白TRH mRNA正常血糖组0.66±0.01　1.44±0.10轻度低血糖组　0.34±0.01Δ　0.54±0.04Δ重度低血糖组　0.52±0.07Δ▲　2.42±0.97Δ▲

3　讨论

下丘脑-垂体-甲状腺轴的活性在能量平衡中至关重要，对身体和心理应激起着不同的调节作用。既往关于应激时甲状腺轴改变报道不一，曾有报道显示运动、焦虑、明暗交替等应激时甲状腺轴会被抑制［3］，可能是通过降低代谢而保存能量。饥饿时人类T3、T4、TSH降低，低甲状腺素水平无法激发TRH产生增多。在饥饿的啮齿类动物中，除了甲状腺激素水平降低外，还观察到释放到垂体门脉系统的TRH减少，TRH mRNA水平降低。外科手术或重症创伤等应激刺激可引起生长抑素的分泌，使TSH释放减少，T3、T4分泌减少，以减少机体的代谢消耗。大鼠慢性不可预见应激可引起T3、T4下降，并能干扰下丘脑-垂体-甲状腺轴的日节律［4］。Uribe等［5］发现Wistar大鼠下丘脑室旁核TRH mRNA和TSH下降后，垂体前叶TRHR1 mRNA水平升高，血甲状腺激素水平不变。TRH神经元接受中枢神经系统其他部位的调控，这些部位的神经元将环境刺激与TRH神经元网络起来，并借TRH神经元与腺垂体建立神经-体液调节联系。例如寒冷刺激的信息传递到中枢神经系统后，一方面再传递到下丘脑的体温调节中枢，另一方面又立即传递到附近的TRH神经元，使TRH分泌增多，进而增加TSH的分泌，血T3、T4随之升高。

危重疾病时由于组织损害及内环境严重失调，应激可以使甲状腺激素代谢途径改变，血清T3、T4水平发生变化，这种临床现象被称为非甲状腺疾病综合征，又称低T3综合征或甲状腺功能正常病态综合征，几乎在所有的急性或慢性非甲状腺疾病患者都会发生［6～8］。循环中T3的分泌有20%来自于甲状腺，由肝细胞的Ⅰ型碘化甲状腺原氨酸5'-脱碘酶对T4的转化而来。非甲状腺疾病综合征时肝脏中该酶作用障碍，使得血清T3水平降低，血清反T3水平升高。低水平的T3反过来会进一步减少5'-脱碘酶的产生，最终导致血浆T3浓度呈螺旋式下降［8］。与此同时，TSH的水平通常保持在正常范围内，或仅有轻度增加。约50%非甲状腺疾病综合征患者也会出现TSH水平下降，提示这种伴随情况可能来自下丘脑/垂体的调控［9］。引起这些变化的机制仍存在争议，可能是应激状态下机体降低新陈代谢率的适应性调节，或是某种潜在生理调控过程的结果。

本研究发现，急性低血糖时大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴表现为血清FT4、TSH降低，FT3不变，下丘脑组织中TRH蛋白表达降低，TRH mRNA表达先降低后升高。可见急性低血糖作为一种急性应激状态，下丘脑-垂体-甲状腺轴此时处于被抑制状态。既往曾有日本学者报道给予胰岛素时会引起下丘脑TRH先降低后升高，从而刺激TSH分泌增多，T3增多。这是

胰岛素对下丘脑的作用，还是急性低血糖对下丘脑的作用，还有待于进一步探讨。中枢对低血糖的调控有重要作用，严重低血糖的发生主要原因在于中枢对低血糖的拮抗调节系统没有被激活，因此寻找这种中枢不能有效启动拮抗调节的机制就十分重要。而感知低血糖的特殊神经元分布在门静脉和脑。血糖感受神经元能感受到其所处环境中血糖的变化，并且相应地改变其代谢率。在大脑皮质下区分布着更高级的血糖感受调控系统，其对低血糖发出应激信号，产生对低血糖的神经内分泌负调节反应( CRR)。对低血糖的CRR包括兴奋交感神经，刺激高血糖素的分泌及影响下丘脑垂体肾上腺轴。这些产生应激信号的皮质下区通过神经纤维和下丘脑等部位联系，应激时通过各系统共同作用维持机体能量平衡。在下丘脑中，神经元的肽类激素组成各种不同功能的调节环路。CRH和TRH组成的环路主要是调节热能生产和应激反应。TRH还是瘦素/神经肽的食欲和体质量调节环路中的成员，参与食欲、摄食、饱感、体质量和热能生成的中枢调节。因此，TRH在中枢对低血糖的调控方面可能发挥一定的作用。

参考文献:

［1］王竹，杨月欣，向雪松，等.实验大鼠血糖正常范围的估算［J］.卫生研究，2010，39( 2) : 133-142.

［2］高俊杰，阎胜利，王婷婷.实验性低血糖对糖尿病大鼠血清内皮素-1的影响［J］.中国糖尿病杂志，2013，21( 8) : 749-751.

［3］Gutiérrez-Mariscal M，Sánchez E，García-Vázquez A，et al.Acute response of hypophysio -tropicthyrotropin releasing hormone neurons and thyrotropin release to behavioral paradigms producing varying intensities of stress and physical activity［J］.Regul Pept，2012，179( 1-3) : 61-70.

［4］Guo TY，Liu LJ，Xu LZ，et al.Alterations of the daily rhythms of HPT axis induced by chronic unpredicted mild stress in rats［J］.Endocrine，2015，48( 2) : 637-643.

［5］Uribe RM，Jaimes-Hoy L，Ramírez-Martínez C，et al.Voluntary exercise adapts the hypothalamus-pituitary-thyroid axis in male rats ［J］.Endocrinology，2014，155( 5) : 2020-2030.

［6］Alevizaki M，Synetou M，Xynos K，et al.Low triiodothyronine: a strong predictor of outcome in acute stroke patients［J］.Eur J Clin Invest，2007，37( 8) : 651-657.

［7］IltumurK，Olmez G，Ariturk Z，et al.Clinical investigation: thyroid function test abnormalities in cardiac arrest associated with acute coronary syndrome［J］.Critical Care，2005，9( 4) : 416-424.

［8］Hennemann G，Krenning EP.The kinetics of thyroid hormone transporters and their role in non-thyroidal illness and starvation［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2007，21( 2) :323-338.

［9］Forestier E，Vinzio S，Sapin R，et al.Increased reverse triiodothyronine is associated with shorter survival in independently-living elderly: the Alsanut study［J］.Eur J Endocrinol，2009，160( 2) : 207-214.

收稿日期:( 2015-04-27)

通信作者:姜雅秋

基金项目:辽宁省科学技术计划重大、重点项目( 2012225021)。

文章编号:1002-266X( 2015)31-0030-03

文献标志码:A

中图分类号:R363.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.011