和厚朴酚衍生物的合成及其抗焦虑活性研究

·化学·

和厚朴酚衍生物的合成及其抗焦虑活性研究

崔帅，张剑，黄建梅，蒋芦荻，梁英喜，李斌，叶小彤，张小华*

(北京中医药大学中药学院,北京100102)

摘要：目的合成和厚朴酚衍生物并对其抗焦虑活性进行评价，进而初步分析和厚朴酚中抗焦虑作用的药效基团。方法以中药厚朴中活性成分和厚朴酚为原料，通过甲基化、还原、电子重排、硼氢化等反应合成了和厚朴酚衍生物，并采用目前国内外常用的抗焦虑评价模型“高架十字迷宫”法对原料及所得衍生物在不同剂量下进行了活性评价。结果所得和厚朴酚衍生物经光谱方法鉴定了结构，其中化合物1和2具有明显的抗焦虑活性。结论对所得化合物进行活性评价，其中有2种衍生物具有抗焦虑活性，并通过结果分析得出和厚朴酚中侧链端基是抗焦虑必需的药效团，酚羟基对抗焦虑活性有一定影响。

关键词：和厚朴酚衍生物；合成；抗焦虑；活性评价

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.018

中图分类号：R914

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2015)03-0279-04

Abstract:ObjectiveTo analyze the anti-anxiety pharmacophore of honokiol, five honokiol derivatives were synthesized and their anti-anxiety activities were evaluated. Methods The derivatives were synthesized through methylation, reduction, electronic rearrangement, hydroboration and so on using the active ingredient honokiol in traditional Chinese medicine Houpu as raw material. The raw material and derivatives were evaluated in different doses by the method of high plus maze. Results The structures of the derivatives were characterized by spectral techniques. Compound 1 and 2 showed obvious anti-anxiety activity. Conclusion The activities of the obtained compounds were evaluated and two of them had the anti-anxiety activity. The results also showed that the double bonds of honokiol are the essential groups; the phenolic hydroxyl groups have an effect on anti-anxiety activity and the position of them does not much affect the biological activity.

基金项目：国家自然科学基金项目(编号:81173541)；北京中医药大学自主课题(编号:2014-JYBZZ-XS-107)

作者简介：崔帅，男，硕士研究生

收稿日期：(2014-12-04)

Synthesis and anti-anxiety activity evaluation of honokiol derivatives

CUI Shuai, ZHANG Jian, HUANG Jianmei, JIANG Ludi, LIANG Yingxi, LI Bin, YE Xiaotong, ZHANG Xiaohua*( School of Chinese Pharmacy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

Key words: honokiol derivatives; synthesis; anti-anxiety；evaluation of activity

*通信作者：张小华，女，教授

随着近年来生活节奏的加快，人们的精神压力越大，焦虑症成了现代社会的常见病、高发病。据统计,人群中约有3.6%～28.8%的人终身患此病,而发达国家尤为严重，且增长趋势愈加明显[1-2]。此类疾病通常伴随躯体的不适，如疲劳、食欲不振以及各种神经功能紊乱，如情绪失控、记忆力减退等[3-4]。不但影响个人的身心健康，还对工作、社交能力及躯体活动有显著的影响。焦虑症已成为人们适应快节奏社会的一大危险障碍，其防治工作已引起社会和医学界的广泛关注。

中药以其毒性低、不良反应少、保护靶器官、多目标、多途径等优势备受关注，因而从中药中寻找新型精神疾病治疗药物也是一种有效的途径[5-8]。和厚朴酚(honokiol)是中药厚朴的有效成分之一，现代研究结果表明，和厚朴酚具有抗氧化、抗炎、抗心律失常、抗肿瘤、抗菌等广泛的药理作用[9-11]。近年研究发现，和厚朴酚还具有精神调节作用，尤其是抗焦虑作用显著[13]，但是该化合物在抗焦虑活性方面除了一些数据外，再无深入研究。本文对和厚朴酚抗焦虑活性做了进一步研究，发现其在较低剂量(2.5mg·kg-1)下即可对小鼠产生明显抗焦虑活性，起效迅速，并且对小鼠的自主活动无影响。在此基础上，通过结构修饰的手段得到了和厚朴酚衍生物，并通过高架十字迷宫法进行了抗焦虑活性的评价[14-15]。通过对结果的分析，对和厚朴酚抗焦虑起效基团进行了初步探究，为发现新型的抗焦虑先导化合物奠定基础。

1仪器与材料

1.1仪器85-2型恒温磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；X-5 型显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司)；ZF-20D型暗箱式紫外分析仪(巩义市予华仪器有限责任公司)；Bruker Avance DRX-500 型超导核磁共振仪；小鼠高架十字迷宫(EPM)：由2个开放臂(open arms)、2个闭合臂(enclosed arms)以及1个连接4个臂的中央平台(central platform)组成一个类似“十”字形的迷宫，2个闭合臂端由白色聚丙烯材料制成，4个臂及中央平台均为黑色，整体固定于一个金属材质的“十”字形支架上，使迷宫高于实验室地面50 cm，实验情况由高架十字迷宫上方的摄像头摄录，实验指标由软件自行记录。

1.2材料和厚朴酚(honokiol，陕西森弗生物技术有限公司)；地西泮(diazepam，北京大学中国药物依赖性研究所)；所用试剂和溶剂均为分析纯；青岛海洋化工厂200~300目柱层析硅胶。

1.3动物SPF级KM小鼠，雄性，体质量20±2 g(北京大学医学部实验动物部)。

2方法与结果

2.1和厚朴酚衍生物的合成

2.1.13′,5-二烯丙基-2,4′-二甲氧基-联苯(1)的合成将0.266 g(1 mmol)和厚朴酚、0.162 g(0.5 mmol)四丁基溴化铵和0.337 g(3 mmol)叔丁醇钾溶于5 mL碳酸二甲酯中，加热至90 ℃，回流反应6 h。反应结束后，待反应体系降至室温，加入10 mL蒸馏水，二氯甲烷萃取(20 mL×3)，合并萃取液并减压蒸干溶剂。硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯=4∶1和石油醚-乙酸乙酯=2∶1梯度洗脱，合并洗脱液，减压蒸干溶剂，得无色油状液体(1)0.183 g。收率62.3%。见图1。1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 7.41 (d, 1H, Ar-H), 7.35 (s, 1H, Ar-H), 7.15 (dd, 2H, Ar-H), 6.93 (d, 2H,Ar-H), 6.11～5.98 (m, 2H, -CH=), 5.16～5.06 (m, 4H, =CH2), 3.89 (s, 3H, -OCH3), 3.81 (s, 3H, -OCH3), 3.47 (d, 2H, -CH2-), 3.41 (d, 2H, -CH2-)。

图1化合物1的合成

Fig.1 The synthesis of compound 1

2.1.23,3′-二烯丙基-联苯-4,4′-二酚(2)的合成将0.186 g(1 mmol)4,4′-联苯二酚、0.312 g(2.6 mmol)溴丙烯和0.276 g(2 mmol)无水碳酸钾加入20 mL丙酮中，加热至60 ℃，回流反应6 h。反应结束后，待反应体系降至室温，静置，抽滤得无色液体，减压蒸干溶剂，得无色针状结晶0.259 g。取上述无色针状结晶0.200 g，加入20 mL乙二醇溶解，在氮气保护下缓慢升温至200 ℃，加热反应12 h。反应结束后，待反应体系降至室温，加入大量蒸馏水，用氯仿萃取(25 mL×3)，合并萃取液，减压蒸干溶剂。硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯=8∶1和石油醚-乙酸乙酯=4∶1梯度洗脱，合并洗脱液，减压蒸干溶剂，得淡粉色粉末状固体(2)0.079 g，收率39.5%，熔点93.7～95.5℃。见图2。1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 7.14 (dd, 2H, Ar-H), 7.08 (d, 2H, Ar-H), 6.96 (d, 2H, Ar-H), 5.96 (td, 2H, -CH=), 5.09 (dd, 4H, =CH2), 3.37 (d, 4H, -CH2-)。

图2化合物2的合成

Fig.2 The synthesis of compound 2

2.1.33′,5-二-(2-丙烯基)-联苯-2,4′-二酚(3)的合成将0.600 g(15 mmol)氢氧化钠溶于20 mL乙二醇，边搅拌边缓慢升温至140 ℃，使氢氧化钠全部溶解。在此温度下，分批加入0.266 g(1 mmol)和厚朴酚，升高温度至180 ℃继续反应4 h。反应结束后，待反应体系降至室温，加入适量蒸馏水，用0.5 mol·L-1盐酸调至酸性，乙酸乙酯萃取(25 mL×3)，合并萃取液并减压蒸干溶剂。柱分离，以石油醚-乙酸乙酯=8∶1和石油醚-乙酸乙酯=4∶1梯度洗脱，合并洗脱液，减压蒸干溶剂，得无色粉末状固体(3)0.196 g，收率73.3%，熔点82.8～83.6 ℃。见图3。1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 7.03 (s, 2H, Ar-H), 6.99 (d, 2H, Ar-H), 6.77 (d, 2H, Ar-H), 6.18～6.08 (m, 2H, -CH=), 5.48 (d, 1H, =CH-), 5.32 (d, 1H, =CH-), 2.32 (d, 3H, -CH3), 2.29 (d, 3H, -CH3)。

图3化合物3的合成

Fig.3 The synthesis of compound 3

图4化合物4的合成

Fig.4 The synthesis of compound 4

2.1.43′,5-二丙基-联苯-2,4′-二酚(4)的合成将0.266 g(1 mmol)和厚朴酚与0.628 g(1.5 mmol)六水合氯化镍用20 mL无水甲醇溶解，冰盐浴下搅拌均匀。搅拌下缓慢加入0.760 g(20 mmol)硼氢化钠，控制体系温度不超过5 ℃，在此温度下搅拌0.5 h，之后室温继续搅拌反应1.5 h。反应结束后，抽滤，滤液减压蒸干溶剂。柱分离，以氯仿-甲醇=4∶1洗脱，合并洗脱液，减压蒸干溶剂得无色针状结晶(4)0.230 g，收率85.3%，熔点79.5～80.9 ℃。见图4。1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 7.25 (d, 1H, Ar-H), 7.20 (dd, 1H, Ar-H), 7.09～7.03 (m, 2H, Ar-H), 6.90 (dd, 2H, Ar-H), 2.70～2.63 (m, 2H, -CH2-), 2.60～2.55 (m, 2H, -CH2-), 1.75～1.63 (m, 4H, -CH2-), 1.03 (t, 3H, -CH3), 0.98 (t, 3H, -CH3)。

2.1.53′,5-二-(1-羟丙基)-联苯-2,4′-二酚(5)的合成将0.266 g(1 mmol)和厚朴酚溶于20 mL无水四氢呋喃，冰盐浴下搅拌均匀。搅拌下缓慢加入5 mL硼烷-四氢呋喃络合物，滴加完毕后室温反应2 h，于冰盐浴下滴加1 mol·L-1的氢氧化钠溶液8 mL和300 mL·L-1的双氧水溶液3.2 mL，加入完毕后室温继续反应2 h。反应结束后，减压蒸干溶剂，水洗，用乙酸乙酯萃取(25 mL×3)，合并萃取液，减压蒸干溶剂。柱分离，以石油醚-乙酸乙酯=4∶1洗脱，合并洗脱液，减压蒸干溶剂得无色油状液体(5)0.218 g。收率72.3%。见图5。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ:9.23 (s, 1H, -OH), 9.07 (s,1H,-OH), 7.22(s,1H, Ar-H), 7.18 (d, 1H, Ar-H), 6.99 (s, 1H, Ar-H), 6.89 (d, 1H, Ar-H),6.78 (dd,2H,Ar-H),4.45 (d,2H,-OH), 3.47～3.38 (m, 4H, -CH2-), 2.55 (dd, 4H,-CH2), 1.69 (dd, 4H, -CH2)。

图5化合物5的合成

Fig.5 The synthesis of compound 5

2.2和厚朴酚及其衍生物抗焦虑活性评价和厚朴酚、阳性对照药(地西泮)及所合成衍生物实验时按所需剂量用50 g·L-1羧甲基纤维素钠配制成不同质量浓度备用。

将40只SPF级KM小鼠随机分为5组，分别为：溶剂空白组(50 g·L-1羧甲基纤维素钠)、阳性对照组(地西泮0.5 mg·kg-1)及所合成化合物的低、中、高剂量组，每组8只。各组均灌胃给药，给药体积为0.01 mL·g-1。给药形式为单次给药，即各组均给药1次，并于给药30 min后进行行为测试，所有实验均在8:00~14:00进行。

测试前将小鼠单独放置，自由活动5 min，测试时，将小鼠置于迷宫中央，小鼠的头朝向其中一个开放臂, 释放后即开始记录6 min内小鼠在迷宫中的以下指标：(1)进入开放臂次数(open arm entry，OE)：进入到任一开放臂的次数,以小鼠投射面积的65%进入臂内为准；(2)开放臂停留时间(open arm time，OT)：单位：s。每次测试完成后用酒精清洁迷宫，再进行下一次测试。

2.3结果结果见图6、图7及表1和表2。从图6、图7可以看出,和厚朴酚起效迅速，单次给药30 min后即可有显著的抗焦虑活性；从表1、表2可以看出,和厚朴酚及化合物1、化合物2均具有抗焦虑活性，但化合物1在低剂量下未显示出抗焦虑活性，说明其活性比和厚朴酚有所降低。化合物3、化合物4、化合物5在3个剂量下均没有抗焦虑活性。

图6和厚朴酚单次给药30 min后对小鼠在开放臂停留时间的影响

Fig.6 The effect of honokiol on the time of mice staying in the open arms

图7和厚朴酚单次给药30 min后对小鼠进入开放臂次数的影响

Fig.7 The effect of honokiol on the number of mice into the open arms

注：与溶剂空白组t检验比较：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

表1目标化合物对小鼠进入开放臂次数的影响

Tab.1 The impact of target compounds on the times of mouse into the open arms

化合物OE(x±s,次)溶剂空白组阳性对照组(0.5mg·kg-1)低剂量组(2.5mg·kg-1)中剂量组(5mg·kg-1)高剂量组(10mg·kg-1)和厚朴酚5.1±0.415.8±2.2***7.6±0.6**8.2±0.9***8.9±1.4***Ⅰ5.4±0.614.1±1.3***7.8±1.110.4±0.8***8.8±0.9**Ⅱ5.1±0.415.8±2.2***9.4±0.7***8.9±0.9**9.8±0.8***Ⅲ5.1±0.215.5±1.0***6.0±0.36.9±0.76.9±0.7Ⅳ4.1±0.914.0±2.4***5.5±1.05.3±0.74.1±0.9Ⅴ4.6±0.311.9±1.1***5.1±0.86.4±1.45.0±1.3

注：与溶剂空白组t检验比较：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

表2目标化合物对小鼠在开放臂停留时间的影响

Tab.2 The impact of target compounds on the time of mouse staying in the open arms

化合物OT(x±s,s)溶剂空白组阳性对照组(0.5mg·kg-1)低剂量组(2.5mg·kg-1)中剂量组(5mg·kg-1)高剂量组(10mg·kg-1)和厚朴酚29.3±2.692.3±10.6***50.5±4.5**56.8±2.8***63.7±6.1***Ⅰ33.1±3.082.6±4.2***45.6±6.054.4±6.5**52.8±2.9***Ⅱ29.3±2.694.9±10.8***49.4±3.0***48.5±4.3**66.1±6.1***Ⅲ29.5±2.495.9±5.0***34.8±2.740.1±5.438.5±4.1Ⅳ42.1±7.4153.9±14.8***47.0±8.553.0±5.050.8±10.0Ⅴ50.0±0.6124.8±7.6***51.0±11.183.2±16.756.4±14.9

注：与溶剂空白组t检验比较：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3讨论

实验结果表明，和厚朴酚及其衍生物1和衍生物2具有明显的抗焦虑活性。化合物1与和厚朴酚的差别在于酚羟基的有无，其活性降低，但在中、高剂量下仍有活性，说明和厚朴酚中酚羟基是抗焦虑药效团但并不是必需药效团。化合物2在3个剂量下均具有抗焦虑活性，且与和厚朴酚抗焦虑活性没有显著性差异(P>0.05)，说明酚羟基位置对化合物活性影响不大。化合物3、化合物4、化合物5在3个剂量下均未显示出抗焦虑活性，说明和厚朴酚中侧链上端基是必需药效团且双键位置对活性亦有影响。

本文合成了5个和厚朴酚衍生物，合成方法简单，条件温和，产率较高，得到了2个具有明显抗焦虑活性的化合物，并通过结果初步分析了和厚朴酚中主要官能团对抗焦虑活性的影响，为进一步研究和厚朴酚抗焦虑作用的机制及发现新型抗焦虑先导化合物奠定了基础。

参考文献：

[1]Bystritsky A, Kerwin L, Feusner J D, et al. A pilot controlled trial of bupropion XL versus escitalopram in generalized anxiety disorder [J]. Psychopharmacol Bull, 2008, 41(1): 46-51．

[2]Patten S B. Recall bias and major depression life time prevalence[J]. Soc Psychiatry Psychiatric Epidemiol, 2003, 38(6): 290-296．

[3]Antai-Otong D. Current treatment of generalized anxiety disorder[J]. J Psychosoc Nurs Men, 2003, 41(12):20-29.

[4]Murphy J M, Leighton A H. Anxiety: Its role in the history of psychiatric epidemiology[J]. Psychol Med, 2009, 39(7):1055-1064.

[5]Tabassum N, Ahmad F. Role of natural herbs in the treatment of hypertension[J]. Pharmacogn Rev, 2011, 5, 30-40.

[6]Xiong X J,Yang X C, Liu Y M,et al. Chinese herbal formulas for treating hypertension in traditional Chinese medicine: Perspective of modern science[J]. Hypertens Res, 2013,36:570-579.

[7]Wang Z L, Yang L Y, Yang X W,et al. Advances in the first total synthesis of natural flavonoids[J]. Synthetic Commun, 2013, 23: 3093-3114.

[8]张思恒, 刘秋桂. 中草药毒性浅析[J]. 西北药学杂志, 2010,25 (4): 319-320.

[9]Dikalov S, Losik T, Arbiser J L. Honokiol is a potent scavenger of superoxide and peroxylradicals[J]. Biochem Pharmacol, 2008, 76(5):589-596.

[10] Cho S Y, Lee J H, Bae K H, et al. Anti-gastritic effects of magnolol and honokiol from the stem bark of magnolia obovata[J]. Biomol Ther, 2010, 16 (3):270-276.

[11]LuoY, Xu Y, Chen L, et al. Semi-synthesis and anti-proliferative activity evaluation of novel analogues of Honokiol[J].Bioorg Med Chem Lett, 2009, 19(9):4702-4705.

[12]KimY S,Lee J Y,Park J, et al. Synthesis and microbiological evaluation of honokiol derivatives as new antimicrobial agents[J]. Arch Pharm Res, 2010, 33 (1) 61-65.

[13]Zhao C, Liu Z Q. Comparison of antioxidant abilities of magnolol and honokiol to scavenge radicals and to protect DNA[J]. Biochimie,2011, 93(10):1755-1760.

[14]徐小平,席志芳.复方酸枣仁汤的药效学研究[J].西北药学杂志, 2002, 17(5):210-212.

[15]彭敏, 石晋丽,郑虎占,等.蜘蛛香抗焦虑复方的抗焦虑作用及其机制[J]. 中草药, 2011, 42(11): 2283-2286.