Y-27632对低氧性肺动脉收缩的作用

·药理·

Y-27632对低氧性肺动脉收缩的作用

刘蕾，沈歆，张志武，肖雄，李小强*

(第四军医大学药学院药理学教研室，西安710032)

摘要：目的探讨Y-27632对低氧性肺动脉收缩的作用及其机制。方法建立小鼠低氧损伤模型；采用微血管张力实验测定肺动脉收缩力，WB检测TRPC6蛋白表达，离子影像技术测定平滑肌细胞全细胞钙变化。结果与对照组比较，CPA诱导低氧组肺动脉的收缩(加强到了167.9%±68.6%, `*P<0.05；Y-27632可显著抑制这一变化(抑制率为47.3%±17.8%, `#P<0.05)；低氧可致肺动脉血管TRPC6蛋白表达显著增加(增加到154.8%±34.3%, `*P<0.05)，这一变化可被Y-27632显著降低(降低到134.2%±18.2%, `#P<0.05)；CPA诱导低氧组肺动脉平滑肌细胞[Ca`(2+)]i显著升高(荧光比率升高到188.9%±46.6%, `*P<0.05)，此作用可被Y-27632显著抑制(荧光比率降低了46.7%±14.5%, `#P<0.05)。结论ROCK抑制剂Y-27632可通过调控TRPC6蛋白表达及其介导的[Ca`(2+)]i变化，重要性地参与低氧性肺动脉收缩。

关键词:钙离子；低氧性肺动脉收缩；经典瞬时受体电位通道蛋白；Y-27632

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.011

中图分类号：R965

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2015)03-0253-04

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Y-27632 on hypoxic pulmonary vasoconstriction and the potential mechanism. Methods Hypoxia-induced injury model was made in mouse. CPA-induced muscle contraction was detected by capillary tension experiment. To explore the expression of TRPC6, WB and immunofluorescence staining experiments were performed. Ca`(2+) was measured using a fluorescence imaging system. Results CPA-induced muscle contraction was enhanced by 167.9%±68.6% in hypoxic pulmonary artery compared with control, which was markedly inhibited by Y-27632(inhibition ratio was 47.3%±17.8%, `#P<0.05). The expression of TRPC6 induced by hypoxia was markedly increased (to 154.8%±34.3%, `*P<0.05). After treatment with Y-27632, the expression of TRPC6 was significantly decreased compared with hypoxia mice (to 134.2%±18.2%, `#P<0.05). Ca`(2+) influx in pulmonary artery smooth muscle cells elicited by store depletion using CPA were dramatically augmented in hypoxia group by 188.9%±46.6% in the ratio of 340 nm/380 nm(`*P<0.05). However, Y-27632 obviously attenuated this change by 46.7%±14.5%(`#P<0.05).Conclusion Inhibition of ROCK by Y-27632 can importantly take part in HPV via the regulation of TRPC6 expression in pulmonary artery, which mediated extracellular Ca`(2+) influx.

基金项目：国家自然科学基金(No.81170107,No.30800433)

作者简介：刘蕾，女，硕士研究生

收稿日期：(2015-01-30)

Effect of Y-27632 on hypoxic pulmonary vasoconstriction

LIU Lei, SHEN Xin, ZHANG Zhiwu, XIAO Xiong, LI Xiaoqiang*(Department of Pharmacology, School of Pharmacy,the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China)

Key words: calcium; hypoxic pulmonary vasoconstriction; TRPC channel; Y-27632

*通信作者：李小强，男，副教授，硕士研究生导师

低氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV) 是低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)形成的基本病理生理特征之一[1,2]。寻找针对HPV的防治药物是肺动脉高压治疗的重要策略。研究发现[3]，RhoA蛋白及其下游效应因子Rho激酶(Rho-kinase, ROCK)通路参与了HPH的发生、发展，ROCK抑制剂是一种很有希望的PH治疗药物。Y-27632作为一种ROCK抑制剂，是否能在HPV中发挥作用，目前尚不清楚，有待深入研究[4]。本研究通过检测Y-27632对环匹阿尼酸(CPA)诱导的肺动脉血管收缩，经典瞬时受体电位通道6(transient receptor potential canonical channel, TRPC6)的蛋白表达及其介导的细胞内Ca2+动员等的影响，以明确其对HPV的作用，探讨其可能的机制。

1仪器与材料

1.1仪器WB化学发光成像检测系统(Tanon公司)；雷磁PHS-3C pH计(上海精密科学化学有限公司)；AB135-S精密天平(METTLER公司)；SCIENTZ-IID型超声波细胞粉碎仪(宁波新芝生物有限公司)；5415R低温离心机(Eppendorf公司)；TILL离子影像系统(TILL公司)；Power Lab系统(AD公司)；激光共聚焦显微镜(Olympus公司)。

1.2试药TRPC6抗体(Alomone labs公司，ACC017AN4102)；化学发光剂(Millipore公司， 1201601) ；CPA(Cayman公司，45k8247)；Y-27632(Sigma公司，040M1912V)；木瓜蛋白酶(Sigma公司，110M7017V)；Ⅱ型胶原酶(Sigma公司，45k8247)；SKF-96365(Sigma公司，030M4622V)。

1.3动物8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体质量18～20 g，由第四军医大学动物实验中心提供。

2实验方法

2.1缺氧模型的建立实验小鼠随机分为3组：对照组，缺氧条件下的模型组和Y-27632给药组。将小鼠置于缺氧舱中，通入100 mL·L-1氧气(空气与氮气体积比1∶1)的低氧条件下进行缺氧，每天持续8 h，持续6周。给药组在每天缺氧前腹腔注射Y-27632(剂量为10 mg·kg-1·d-1)，对照组和缺氧组小鼠注射相当体积的生理盐水。

2.2细胞分离与培养麻醉小鼠，用750 mL·L-1乙醇消毒，开胸迅速取出心肺，置于无菌PSS中漂洗；显微镜下分离出肺动脉并剪碎，放入37 ℃木瓜蛋白酶(1 g·L-1)中消化20 min；吸去上清，加入Ⅱ型胶原酶(1 g·L-1)溶液，消化20 min；吸上清，加5 mL改良Eagle培养基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)，吹打吹散细胞，过滤，以1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，用含200 mL·L-1胎牛血清(FBS)的DMEM吹悬，接种于培养瓶/板。对照组置于37 ℃常氧培养箱中培养，缺氧组置于自制的有机玻璃盒内，密闭后放入培养箱，给药组按10 μmol·L-1给予Y-27632后，缺氧培养。

2.3微血管张力的测定分离肺动脉血管，剪成1 mm小段，将2根金属丝插入血管环管腔中，移入充满5 mL 含2 mmol·L-1Ca2+生理盐水(PSS)的37 ℃恒温浴槽，持续通以体积分数95%O2与5%CO2的混合气体[5-6]；打开Powerlab生物信号采集系统，调用事先设置的肺动脉张力模板，调零后，调节肺动脉环负荷约2~3 mN的基础张力，平衡45 min后，用2 mmol·L-1Ca2+PSS冲洗3次，平衡后，换用0 Ca2+PSS溶液进行后续实验：依次向浴槽中加入硝苯地平(Nif, 5 μmol·L-1)，CPA(10 μmol·L-1)，2 Ca2+PSS，SKF-96365(10 μmol·L-1)。

2.4WB法检测蛋白表达采用WB法对肺动脉平滑肌细胞(PASMSs)TRPC6蛋白的表达进行检测。收集各组PASMSs，加入预冷的裂解缓冲液，裂解30 min，4 ℃以1 2000 r·min-1离心15 min。取上清测蛋白浓度。以每泳道20 μg蛋白等量样品上样，以100 mL·L-1SDS-聚丙烯酰胺水溶液进行凝胶电泳分离蛋白。电泳后将蛋白电转到NC膜上，将膜用50 g·L-1脱脂奶粉溶液37 ℃封闭2 h后，与TRPC6一抗在37 ℃反应2 h，PBST清洗3次，再与辣根酶标记的二抗37 ℃反应1 h，用PBST充分洗涤后，进行化学发光检测，以β-actin作为内参照，分析TRPC6蛋白的相对表达量。

2.5免疫荧光染色实验将消化所得的细胞，按每孔1×105的数量接种于无菌玻片上，于6孔板中培养，按2.2方法进行分组培养24 h；移去培养液，用PBS漂洗后，加入40 mL·L-1多聚甲醛水溶液室温固定20 min；再用PBS漂洗，用山羊血清封闭液(含1 mL·L-1Triton水溶液)封闭30 min；吸去封闭液，加一抗(1∶150)4 ℃过夜；取出后用PBS充分漂洗，37 ℃荧光二抗(1∶200)避光孵育2 h；再漂洗后，与Hoechest(1∶100)共孵育10 min；最后用PBS漂洗，500 mL·L-1甘油水溶液封片。应用激光扫描共聚焦显微镜(奥林巴斯)对细胞进行XY面扫描，记录并分析细胞TRPC6蛋白的表达情况。

2.6细胞内Ca2+浓度的测定将加微量细胞悬液置于浴槽中与等体积荧光染料 Fluo-2/AM(5 μmol·L-1)混合避光孵育40 min，用含2 mmol·L-1Ca2+的生理盐溶液(PSS)充分灌流冲洗细胞外多余染料，再用无钙(0 Ca2+)PSS平衡5 min。实验时，用340与380 nm的激发光激发胞内荧光探针Fura-2，用CCD拍摄荧光的动态变化。实验中，加入5 μmol·L-1Nif 以阻断电压依赖性钙通道(voltage-dependent calcium channel, VDCC)，加入10 μmol·L-1CPA充分作用(抑制肌浆网Ca2+泵，以耗竭细胞内钙库中的Ca2+，激活钙库操纵性钙通道，最终引起[Ca2+]i显著升高)，继而加2 mmol·L-1Ca2+PSS溶液，观察并记录肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]i变化。

3结果

3.1Y-27632对CPA诱导的小鼠肺动脉收缩的影响应用10 μmol·L-1CPA耗竭肺动脉细胞钙库中的Ca2+，在2 mmol·L-1Ca2+PSS条件下，可诱导肺动脉收缩；结果见图1所示：与对照组比较，CPA诱导低氧组肺动脉产生了显著地收缩，*P<0.05；与低氧组比较，Y-27632可显著地抑制CPA诱导的肺动脉的收缩，#P<0.05；10 μmol·L-1TRPC通道阻断剂SKF-96365完全阻断了3个组的血管收缩反应。

3.2Y-27632对缺氧致TRPC6蛋白表达升高的影响TRPC6通道蛋白是钙库操纵性钙通道构成的重要成分[7]。如图2 WB结果所示，缺氧条件下，小鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC6的蛋白表达与对照组相比显著增加，*P<0.05；而与缺氧组相比，Y-27632组小鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC6蛋白表达显著降低，#P<0.05。免疫荧光染色实验结果进一步提示，低氧引起肺动脉平滑肌细胞TRPC6蛋白表达显著升高，这一变化可被ROCK抑制剂Y-27632显著抑制。

图1Y-27632对CPA诱导的小鼠肺动脉收缩的影响

Fig.1 Effect of Y-27632 on CPA-induced muscle contraction in mouse pulmonary arteries.

3.3Y-27632对平滑肌细胞全细胞钙变化的影响为确证Y-27632对低氧引起TRPC6蛋白表达抑制是否影响[Ca2+]i，采用离子影像技术测定了[Ca2+]i的变化。研究结果如图3所示，与正常组比较，CPA诱导缺氧组肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]i显著升高，*P<0.05；而与缺氧组比较，CPA诱导的Y-27632组肺动脉平滑肌细胞 [Ca2+]i升高显著降低，#P<0.05。10 μmol·L-1TRPC通道阻断剂SKF-96365可显著阻断3个组[Ca2+]i的升高。

4讨论

本研究发现，低氧可引起CPA诱导的小鼠肺动脉血管收缩显著加强，ROCK抑制剂Y-27632可显著抑制这一过程，此作用与Y-27632抑制低氧诱导的TRPC6蛋白表达升高，进而减弱由TRPC6介导的细胞内[Ca2+]i的升高密切相关。

以往研究发现[3]，ROCK信号通路磷酸化肌球蛋白轻链磷酸酶亚单位MYPT1可介导“钙敏感机制”，调控肺动脉的收缩。本研究中，ROCK抑制剂Y-27632可明显调控小鼠肺动脉血管收缩，以及低氧引起的小鼠肺动脉血管和肺动脉平滑肌细胞TRPC6蛋白表达的显著升高，提示ROCK信号通路可能也可通过钙依赖机制调控HPV。因为，TRPC通道是瞬时受体电位(TRP)超家族的成员之一，是具有Ca2+可渗透性的非选择性阳离子通道(non-selective cation channel, NSCC)，是受体操纵性钙通道(receptor-operated calcium channel, ROCC)和库操纵性钙通道(store-operated calcium channel, SOCC)的重要组成部分[8-10]。

图2Y-27632对缺氧致肺动脉平滑肌细胞TRPC6蛋白表达升高的影响

A.WB实验结果；B.各组小鼠肺动脉血管TRPC6蛋白表达的相对量；C.各组肺动脉平滑肌细胞TRPC6蛋白表达的免疫荧光检测。n≥3；*P<0.05，表示与对照组相比；#P<0.05，表示与低氧组相比。

Fig.2 Effect of Y-27632 on the expression of TRPC6 in PASMCs under hypoxia

A. original images showing the expression of TRPC6 in mouse PASMCs by WB；B. normalized amount of TRPC6 protein harvested from mouse PASMCs；C. TRPC6 immunofluorescence staining in PASMCs images by using a confocal microscope.*P<0.05, compared with control,#P<0.05，compared with hypoxia group.

图3Y-27632对TRPC6介导的肺动脉平滑肌细胞全细胞钙变化的影响

Fig.3 Effect of Y-27632 on CPA-induced increase in [Ca2+]ithrough TRPC in mouse PASMCs

TRPC激活时可介导NSCC电流，其主要成分为Ca2+流[11]。为此，本研究进一步采用离子影像技术测定了Y-27632对平滑肌细胞[Ca2+]i变化的影响。结果发现，TRPC通道阻断剂SKF-96365可阻断3个组[Ca2+]i的升高，尤其是显著阻断了低氧组细胞[Ca2+]i的升高，结合前述TRPC6蛋白表达的实验结果提示，TRPC6通道是低氧引起[Ca2+]i升高的重要来源。

综上所述，ROCK抑制剂Y-27632可通过调控TRPC6蛋白表达及其介导的细胞[Ca2+]i变化，重要性地参与低氧性肺动脉的收缩。本研究从新的视角对ROCK抑制剂Y-27632调控低氧性肺动脉收缩的分子机制进行了探索，是对ROCK信号通路通过“钙敏感机制”调控低氧性肺动脉收缩机制的重要补充，也为拓展ROCK抑制剂临床应用于肺动脉高压等相关疾病的治疗提供了实验依据。

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