超声结合回流提取对莲心总碱得率的影响

陈　笑，富志军

(中国药科大学中药制剂教研室，南京　210009)



超声结合回流提取对莲心总碱得率的影响

陈笑，富志军*

(中国药科大学中药制剂教研室，南京210009)

摘要：目的考察超声结合回流提取法对莲子心中总生物碱得率的影响。方法以总碱得率为指标，在对影响超声及回流提取因素进行单因素考察的基础上，采用正交实验法优化超声结合回流提取工艺，并与单一回流提取工艺比较。结果正交实验方差分析结果表明，乙醇体积分数和超声时间对莲心总碱得率影响极为显著，其次为超声功率，超声结合回流提取莲心总碱的平均得率可达10.06 mg·g-1，而单一回流提取总碱得率仅为7.14 mg·g-1。 结论与单一回流提取法相比，新技术超声强化提取确能提高总碱得率，减少总生物碱受热时间，从而保护其不受破坏，为莲心总碱的提取提供了高效新颖的方法，也为新技术超声强化提取含不稳定有效成分中药材进行了有益的探索。

关键词：莲心总碱；超声强化；回流提取；正交实验

莲子心是睡莲科植物莲NelumbonuciferaGaertn.的成熟种子中的干燥幼叶及胚根，性苦、寒，归心、肾经，具有清心安神、交通心肾、涩精止血的功效[1]。现代研究表明，莲子心中含有生物碱、黄酮、谷甾醇、挥发油和微量元素等化学成分。其中生物碱是主要药效成分，也是目前研究最广的成分，主要包括莲心碱、甲基莲心碱、异莲心碱等，具有降血压、抗心律失常、抗血小板聚集、抗脂质过氧化及清除自由基、抗癌等药理作用[2]。关于莲子心生物碱的提取方法，文献报道的有回流法[3]、酸液渗漉法[4]、超声法[5]、半仿生提取法[6]、超声-微波协同萃取法[7]等。回流法因工艺简单，对设备要求低而被广泛采用，但其最大的缺点是提取温度高，在提取过程中，结构中具有多个酚羟基的莲心总碱[8]易被氧化降解；超声波提取法可提高提取效率，缩短提取时间，无需加热，因而能最大限度地保护有效物质的生物活性，是强化提取的重要手段之一[9-10]。本实验旨在热回流提取的基础上，结合超声波强化处理来提取莲心总碱以探讨超声对于回流提取莲心总碱的强化作用，提高提取率，为莲心总碱的开发利用提供高效的提取方法。

1仪器与试药

1.1仪器LC-2010A HT高效液相色谱仪(岛津)；Hedera ODS-2色谱柱(江苏汉邦科技有限公司)；恒温水浴锅B260，RE52CS-1旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；FA/JA型电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；KH-250DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；D2F6090真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2试药莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱对照品(中国科学院成都生物研究所,质量分数均≥98%，批号分别为MUST-12022203，MUST-14022204，MUST-14022205)；药材莲子心购自湖南省高圣中药饮片有限公司，经中国药科大学生药教研室鉴定为睡莲科植物莲NecumbonuciferaGaertn.的成熟种子中的干燥幼叶及胚根；甲醇(江苏汉邦科技有限公司)；无水乙醇、三乙胺(上海泰坦化学有限公司)；氢氧化钠、硫酸(南京化学试剂有限公司)；娃哈哈纯净水(南京娃哈哈饮料有限公司)；甲醇为色谱纯;其他化学试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1莲心总碱含量测定

2.1.1色谱条件色谱柱为汉邦Hedera ODS-2色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.5 mL·L-1三乙胺水溶液(72.5∶27.5)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为283 nm；柱温为25 ℃；进样量为20 μL。见图1。

2.1.2对照品溶液的制备精密称取莲心碱对照品4.9 mg、异莲心碱对照品4.8 mg、甲基莲心碱对照品6.9 mg，分别置于5 mL量瓶中，加适量甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得0.98 mg·mL-1的莲心碱对照品溶液、0.96 mg·mL-1的异莲心碱对照品溶液和1.36 mg·mL-1的甲基莲心碱对照品溶液。分别精密吸取以上3种对照品溶液各2.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得含莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱分别为196，192和272 μg·mL-1的混合对照品储备液，避光，4 ℃冷藏，备用。

图1HPLC图

A.混合对照品；B.总碱提取物；1.莲心碱；2.异莲心碱；3.甲基莲心碱

Fig.1 HPLC chromatograms

A. mixed control substances; B. total alkaloids extract;

1. liensinine; 2. isoliensinine; 3. neferine

2.1.3线性关系考察精密吸取混合对照品储备液0.1，0.3，0.5，0.7，1.0，2.0和3.0 mL，分别置于5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得一系列浓度梯度的对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件依次进样，测定峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，分别以莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱对照品的质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)，进行回归分析，得各生物碱的标准曲线方程。莲心碱：Y=10 181X-2 695，r=0.999 9；异莲心碱：Y=12 083X-4 322，r=0.999 9；甲基莲心碱：Y=13 065X-6 143，r=0.999 9。3种生物碱分别在3.92～117.60，3.84～115.20和5.44～163.20 μg·mL-1范围内呈现良好的线性关系。

2.1.4供试品溶液的制备取实验室自制莲心总碱提取物约10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加适量甲醇超声溶解并定容，精密移取1 mL,用甲醇稀释至10 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.1.5样品含量测定按2.1.4项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件，测定峰面积，并用以下公式计算莲子心提取物中各生物碱含量、总碱含量和总碱得率。

总碱含量(%)=莲心碱(%)+异莲心碱(%)+甲基莲心碱(%)

C：生物碱质量浓度/μg·mL-1;W0：药材质量/g;

W1：总碱提取物/g;W2：供试品量/mg

2.2莲心总碱提取工艺筛选

2.2.1超声结合回流提取方法取药材莲子心粗粉，加入一定体积分数的乙醇，浸泡30 min，超声处理一段时间之后，置于水浴中回流提取，重复数次。提取液合并，减压回收乙醇至近干，加适量质量分数为1%的硫酸溶液溶解，过滤，滤液用质量分数为100 g·L-1的氢氧化钠溶液调pH为7～9，沉淀，放置，过滤并用少量冷水洗涤沉淀3～4次，将所得沉淀置于40 ℃条件下真空干燥(约4 h)，得莲心总碱提取物。

2.2.2单因素实验以总碱得率为指标，考察了以下各因素对莲心总碱得率的影响：粉碎度(完整饮片，不加筛粉碎，20和60目)；提取次数(1，2，3和4次)；回流温度(50，60，70，80和90 ℃)；乙醇体积分数(70%，75%，80%，85%和90%)；乙醇体积(4，6，8，10和12倍)；回流时间(60，90，120，150和180 min)；超声时间(15，30，45和60 min)及超声功率(60，70，80，90和100 W)。结果表明，乙醇体积分数、回流时间、超声时间、超声功率对提取效果的影响较大。4个因素总碱得率的变化均先增加后减少，分别在乙醇体积分数为75%、回流时间为150 min、超声功率为90 W、超声时间为30 min时达到最大值。综合考虑提取效果、时间及成本，其他条件的最优值分别为：药材粒度20目，提取次数2次，回流温度80 ℃，乙醇体积10倍量。

2.2.3正交实验(1)正交实验因素水平表通过以上单因素实验，筛选出对莲心总碱得率影响较大的4个因素：乙醇体积分数(A)、回流时间(B)、超声时间(C)、超声功率(D)，每个因素3个水平，建立正交实验L9(34)表，如表1所示。

表1 因素水平表

Tab.1 The factors and levels of the extraction process

水平因素A.乙醇体积分数/%B.回流时间/minC.超声时间/minD.超声功率/W1701201580275150309038018045100

(2)正交实验安排表及实验结果称取9份莲子心药材粉末(20目)，每份20.0 g，按L9(34)正交表安排实验，以莲心总碱得率为指标，并同时考察各生物碱单体在总碱提取物中的含量随因素水平的变化情况，实验结果及方差分析见表2～6。

由直观分析中各因素的极差可知，对总碱得率影响因素的主次顺序为A>C>D>B，即乙醇体积分数>超声时间>超声功率>回流时间。

表2正交实验结果及直观分析

Tab.2 Orthogonal experimental results and intuitive analysis

实验号A.乙醇体积分数/%B.回流时间/minC.超声时间/minD.超声功率/W莲心碱含量/%异莲心碱含量/%甲基莲心碱含量/%Y.总碱得率/mg·g-1111117.1613.4840.766.62212228.0514.9243.937.33313338.4615.6546.347.95421237.1214.1544.677.96522318.1515.4246.688.57623127.9314.8446.098.02731326.8713.0842.917.34832136.1211.6638.456.22933215.8211.4936.465.97莲心碱含量K17.8907.0507.0707.043K27.7337.4406.9977.617K36.2707.4037.8277.233R1.6200.3900.8300.574异莲心碱含量K114.68313.57013.32713.463K214.80314.00013.52014.280K312.07713.99314.71713.820R2.7260.4301.3900.817甲基莲心碱含量K143.67742.78041.76741.300K245.81343.02041.68744.310K339.27342.96345.31043.153R6.6400.2403.6233.010总碱得率K17.3007.3076.9537.053K28.1837.3737.0877.563K36.5107.3137.9537.377R1.6730.0661.0000.510

表3总碱得率方差分析

Tab.3 Variance analysis of the yield

方差来源SSMSFPA4.2042.102525.500<0.01B(误差)0.0080.0041.000C1.7690.885221.125<0.01D0.3990.20049.875<0.05

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.00(表4,5,6同)。

表3方差分析结果表明，A和C因素对总碱得率具有极显著影响，D因素有显著影响，B因素无显著影响。进一步确定影响莲子心生物碱得率的最关键因素是A(乙醇体积分数)，其次为C(超声时间)，再次为D(超声功率)，B因素(回流时间)的影响较小，可能是由于实验误差所致，故作为误差项。

分析表2～6中各生物碱单体含量的变化，发现莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱在总碱提取物中的含量随各因素水平变化的情况基本一致，影响因素主次顺序均为A>C>D>B。对于莲心碱来说，最佳因素水平组合为A1B2C3D2；异莲心碱为A2B2C3D2；甲基莲心碱为A2B2C3D2；总碱得率为A2B2C3D2。说明各生物碱单体纯度的变化趋势与总碱得率的变化趋势基本平行。由于甲基莲心碱含量最高，对总碱提取结果的影响最为显著、直接。因此，影响总碱得率各因素的显著性分析情况(表3)与影响甲基莲心碱含量各因素的显著性分析情况(表6)最为相似。此结果进一步验证了以总碱得率为指标的正交实验结果的合理性和正确性。

结合正交实验直观分析和方差分析结果得出莲心总碱的最佳提取工艺为：将药材粉碎成20目粉末，加入10倍量体积分数为75%的乙醇，浸泡30 min，90 W超声处理45 min，再于80 ℃条件下加热回流150 min，重复提取2次。

表4莲心碱含量方差分析

Tab.4 Variance analysis of liensinine

方差来源SSMSFPA4.7902.39517.230>0.05B(误差)0.2780.1391.000C1.2670.6344.558>0.05D0.5120.2561.842>0.05

表5异莲心碱含量方差分析

Tab.5 Variance analysis of isoliensinine

方差来源SSMSFPA14.2447.12239.132<0.05B(误差)0.3640.1821.000C3.4011.7019.343>0.05D1.0060.5032.764>0.05

表6甲基莲心碱含量方差分析

Tab.6 Variance analysis of neferine

方差来源SSMSFPA66.72633.363709.851<0.01B(误差)0.0940.0471.000C25.69012.845273.298<0.01D13.8336.917147.160<0.01

(3)验证实验按照上述最佳工艺条件，进行5次验证实验。结果见表7。

结果表明,该超声结合回流提取工艺稳定，结果可靠。

表7验证实验结果

Tab.7 The verification of extraction process

批号药材量/g总碱提取物/g莲心碱含量/%异莲心碱含量/%甲基莲心碱含量/%总碱含量/%总碱得率/mg·g-1平均得率/mg·g-1RSD/%1411060120.8500.29748.6514.9245.5669.149.8610.062.701411060219.9060.27467.9415.2950.5373.7610.181411060319.6770.26038.8715.7749.0473.689.751411060420.1570.260110.3517.3953.1680.9010.441411060520.7660.253710.3717.6754.5682.6010.09

2.3不同方法提取莲心总碱结果比较见表8。

表8不同方法提取莲心总碱结果比较

Tab.8 Comparison of the yields of Lianzixin total alkaloids by different extraction methods

(n=3)

结果表明，超声结合回流提取所得总碱得率明显高于单一回流提取法和超声提取法(P<0.05)。

3讨论

表8显示，单纯使用超声提取，在得率上不如回流提取法，其原因可能是：首先，由于超声波在加速总碱扩散的同时也会产生很多具有较强活性的自由基，与抗氧化物质反应，破坏活性成分[11]；其次，超声提取是在室温下进行，提取温度低，而适当地增加提取温度有利于成分的热运动，加速扩散。因而，尽管超声提取本身有许多优势，但单一使用超声法提取莲心总碱的效果并不理想。

从表8可看出，在回流时间相同(均为150 min)及总提取时间(均为195 min)相同的情况下，超声结合回流工艺提取莲心总碱得率均高于单一回流工艺且有显著性差异；而单一回流195 min的总碱得率相较于150 min不增反减，是由于受热时间延长反而加速不稳定生物碱的降解所致。这一结果说明，超声结合回流提取能有效提高总碱得率。

本实验中超声结合回流提取提高总碱得率的可能机制是：利用超声波产生强烈的空化效应、机械效应和热效应，增大介质分子的运动速度和介质的穿透力，使植物细胞迅速破壁，加速中药有效成分进入溶剂[11]；同时，利用总碱溶解度最大的体积分数75%的乙醇为提取溶剂，加热回流提取，利用适当升温以加速有效成分的热运动，利于其扩散溶出。在这一工艺中超声与回流互相取长补短，从而提高提取效率，缩短提取时间，在一定程度上减少受热时间，使生物碱减少高温破坏。此外，超声对于回流提取的强化作用还可能与超声破坏了溶液中的多糖大分子、从而降低了溶液黏度、减小了对生物碱溶出的传质阻力和吸附作用有关[12]。这一点可由实验中发现的回流195 min的提取液黏度明显大于超声结合回流法提取液黏度这一现象进行证明。

对总碱提取物中各生物碱的含量进行分析，发现最佳工艺得到的总碱提取物中莲心碱平均含量约为9%，异莲心碱约为16%，甲基莲心碱约为51%。其中，甲基莲心碱的含量远高于莲心碱和异莲心碱，造成这一结果可能的原因：一方面是不同产地不同批次莲子心所含各成分的量不同，本实验所用莲子心购自湖南，有文献[13-14]报道,湖南产莲子心中正是以甲基莲心碱含量较高；另一方面可能是与各成分的结构有关，甲基莲心碱只有一个酚羟基，而莲心碱和异莲心碱有2个酚羟基，从结构上来看,甲基莲心碱的稳定性高于莲心碱和异莲心碱。因此,提取得到的甲基莲心碱要偏多。

4总结与展望

本实验通过单因素和正交实验确定了超声结合回流提取的最佳工艺，并通过与不同提取方法比较，验证了这一工艺的合理性和优越性。实验表明，与单一回流提取法相比，新技术超声结合回流提取能有效提高总碱得率，减少总生物碱受热时间，从而保护其不受破坏，为莲心总碱提供了一种高效新颖的提取方法，也为新技术超声强化提取含不稳定有效成分中药材进行了有益的探索。然而，目前国内对于超声结合回流提取天然产物活性物质的报道并不多，超声提取设备也仅限于实验室小规模生产阶段，虽然工业中已有结合了超声装置的多功能提取罐，但是如何使该工艺从单味中药扩大应用到中药复方、从实验室规模放大到工业化生产，仍是今后超声提取研究的方向之一。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中国药典2010年版[S].一部.北京:中国医药科技出版社，2010.

[2]李娟，夏延斌.莲心生物碱保健功能研究[J].粮食与油脂， 2010(1):40-43.

[3]董兰，郑申声，陈昌国.莲心总碱的提取分离及其抗氧化性研究[J].食品工业科技，2011，32(7):329-331.

[4]黄先菊，罗顺德，杨健.酸液渗漉法提取分离莲心碱[J].湖北省卫生职工医学院学报，2002，15(3): 51-52.

[5]李扬，周坚，万盈，等.莲子皮生物碱超声波辅助提取条件优化及抗氧化性研究[J].食品工业科技，2012，33(3):255-258.

[6]袁小红.莲子心4种提取方法的比较研究[J].中国药房， 2006，17(8): 637-638.

[7]张勋，吴仲，李煌，等.3种提取莲子心总生物碱的方法比较[J]. 福建中医药大学学报，2013，23(3):40-41.

[8]许磊，姚崇舜，陈济民.莲心碱的研究概况[J].中草药，2000，31(12):956-958.

[9]杨义芳，孔德云.中药提取分离新技术[M].北京:化学工业出版社，2010:57.

[10]张兆旺.中药药剂学[M]. 北京: 中国中医药出版社， 2003:113.

[11]万水昌，王志祥，乐龙，等.超声提取技术在中药及天然产物提取中的应用[J].西北药学杂志，2008， 23(1):60-62.

[12]王小梅.超声对麦冬多糖结构、溶液行为及生物活性影响的研究[D].西安:陕西师范大学，2013.

[13]何晓娟，孙长海，于江华，等. HPLC测定不同产地莲子心中莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱[J].中草药，2010， 41(5):834-836.

[14]张先洲，蔡鸿生，周延安，等.HPLC同时测定莲子心中莲心碱和甲基莲心碱的含量[J].西北药学杂志， 1994，9(6):243-245.

Effect of ultrasonic combined with reflux extraction on the yield of Lianzixin total alkaloids

CHEN Xiao, FU Zhijun*(Department of Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicine, China PharmaceuticalUniversity, Nanjing 210009, China)

Abstract:ObjectiveTo study the reinforcement effect of ultrasonic on reflux extraction rate of Lianzixin total alkaloids.MethodsOn the basis of single factor experiments, the extraction process was optimized by an orthogonal experimental design with alkaloid yield as an index. And then the extracting effect of the optimal process of ultrasonic combined with reflux extraction was compared with that of single reflux extraction. ResultsVariance analysis results of the orthogonal test showed that ethanol concentration and ultrasonic time were the most significant factors, followed by ultrasonic power. The average rate of ultrasonic combined with reflux extraction was up to 10.06 mg·g-1while that of reflux extraction was only 7.14 mg·g-1. ConclusionNew technology of ultrasonic combined with reflux extraction can actually improve the extration rate of Lianzixin total alkaloids and meanwhile protect the active ingredients from destruction by reducing heating time. This study may provide a novel and efficient explorationfor the extraction of Chinese herbal medicine containing unstable active ingredients.

Key words:Lianzixin total alkaloids; ultrasonic-enhanced; reflux extraction; orthogonal test

收稿日期：(2015-04-01)

通信作者：*富志军，男，副教授，硕士生导师

作者简介：陈笑，女，硕士研究生

中图分类号：R282

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)01-0024-06

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.008