HPLC-CAD法测定远志药材中细叶远志皂苷的含量

刘　可，刘利根

(中国药科大学中药制剂教研室，南京　210009)



HPLC-CAD法测定远志药材中细叶远志皂苷的含量

刘可，刘利根*

(中国药科大学中药制剂教研室，南京210009)

摘要：目的建立高效液相-电雾式检测器(HPLC-CAD)方法测定远志药材中细叶远志皂苷的含量。方法色谱柱为Ultimate XB-C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；柱温25 ℃；流动相为甲醇-0.3 mL·L-1磷酸溶液(60︰40)；流速1 mL·min-1；进样量10 μL；电雾式检测器，雾化温度25 ℃，采集频率10 Hz。结果细叶远志皂苷峰面积与质量浓度线性回归方程：Y= 4.295 4X-0.135 8，r =0.999 9( n=6 )，线性范围为1.0～10.0 mg·mL-1；平均回收率为101.4 %。结论该方法高效、快速、准确，可作为药物及制剂中细叶远志皂苷的含量测定方法。

关键词：远志；细叶远志皂苷；HPLC-CAD；含量测定

远志是远志科植物远志PolygalatenuifoliaWilld.或卵叶远志PolygalasibiricaL.的干燥根[1]。细叶远志皂苷是远志皂苷碱水解的唯一产物，是控制远志总皂苷含量的指标性成分[2]。细叶远志皂苷可以显著抑制Aβ-淀粉样蛋白的分泌[3]，且能透过血脑屏障[4]改善老年记忆障碍小鼠的学习记忆能力[5-6]，具有良好的抗老年痴呆作用。

电雾式检测器(charged aerosol detection，CAD)是一种新型HPLC检测器，灵敏度和重复性高、动态检测范围宽、操作直观简单[7]，不依赖化学结构的信号响应一致性，为通用性检测器，应用于中性、酸性、碱性及两性物质等，特别是无紫外吸收、非挥发性或半挥发性物质的检测[8]。近年来在各领域中显示出非凡的能力。本文采用HPLC-CAD方法测定远志药材中细叶远志皂苷的含量，建立一种准确、快速、高效的含量测定方法，对远志药材及细叶远志皂苷制剂的测定具有参考价值，对其类似化合物的测定提供了参考依据。

1仪器与试药

1.1仪器UltiMate 3000高效液相色谱仪,电雾式检测器，型号：Corona Ultra(美国Thermo Fisher Scientific公司) ；主要配置：泵(含内置脱气机)，型号：HPG-3400；自动进样器，型号：WPS-3000TSL(带自动清洗针功能)；柱温箱，型号：TCC-3000。

1.2试药细叶远志皂苷对照品(中国食品药品检定研究院，含量95.3 %，批号111849-201303)；生远志Ⅰ(购于安徽省万生中药饮片有限公司)，生远志Ⅱ(购于临湘市中药饮片加工厂)，蜜远志(购于亳州市永刚饮片厂)；甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司)；无水乙醇(分析纯，南京化学试剂有限公司)。

2方法与结果

2.1检测条件HPLC条件：Ultimate XB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.3 mL·L-1磷酸溶液(60∶40)；流速:1 mL·min-1；进样量:10 μL；柱温：25 ℃；CAD参数：采集频率10 Hz；雾化温度：25 ℃；

雾化气压：35 psi。

2.2对照品溶液的制备取细叶远志皂苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含10 mg的溶液，超声15 min，定容至刻度，即得对照品储备液。

2.3供试品溶液的制备取远志粉末(过三号筛)约1 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70 %的甲醇50 mL，称定质量，超声1 h，放冷，再称定质量，用体积分数为70%的甲醇补足质量，滤过，取续滤液25 mL，旋干，残渣加100 g·L-1的氢氧化钠溶液50 mL，加热回流2 h，盐酸调pH至4～5，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次50 mL，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加甲醇适量溶解，转移至25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.4线性关系考察精密吸取对照品储备液，以适量的甲醇将其分别稀释为1.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mg·mL-1，按照 2. 1项下色谱条件检测，以细叶远志皂苷质量浓度(X)对峰面积(Y) 进行线性回归，得回归方程:Y=4.295 4X-0.135 8，r=0. 999 9(n=6)。结果表明，细叶远志皂苷在1.0～10.0 mg·mL-1范围内呈线性关系，且线性关系良好。

2.5方法学考察

2.5.1重复性实验取生远志Ⅰ6 份，分别制备供试品溶液[9]，按照2.1项下色谱条件进样测定细叶远志皂苷色谱峰面积，计算其RSD值为 1.2 %。

2.5.2稳定性实验取生远志Ⅰ供试品溶液，按照 2.1项下色谱条件，每次进样10 μL，分别在0，2，4，8，16和24 h进样分析，测定细叶远志皂苷色谱峰面积，计算得其 RSD 值为1.1 %。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.3精密度实验取3.69 mg·mL-1细叶远志皂苷对照品溶液，按照 2. 1项下色谱条件，每次进样10 μL，连续进样6次，测定细叶远志皂苷峰面积，计算得RSD值为 0.5 %。

2.5.4加样回收率实验取1.00 mg·mL-1生远志Ⅰ供试品溶液5 mL，平行3份，分别精密加入3.8，4.9和6.0 mg细叶远志皂苷对照品，按照2.1项下色谱条件，进样分析，测定细叶远志皂苷峰面积，计算加样回收率，结果回收率分别为100.8 %，100.4 %和100.9 %，平均回收率为100.7 %，RSD值为0.3 %。

2.6样品测定取生远志Ⅰ、生远志Ⅱ和蜜远志样品，按照2.3项下方法，分别制备供试品溶液，按照 2.1项下色谱条件分析测定，外标法计算生远志Ⅰ、生远志Ⅱ、蜜远志样品中细叶远志皂苷的质量分数。结果显示，生远志Ⅰ中细叶远志皂苷的质量分数为1.22%；生远志Ⅱ中细叶远志皂苷的质量分数为1.22%；蜜远志中细叶远志皂苷的质量分数为1.56%。见图1。

图1HPLC-CAD图

A．对照品；B．生远志Ⅰ；C．生远志Ⅱ；D．蜜远志

Fig.1 HPLC-CAD chromatograms

A.reference substance; B.crudeRadixpolygalaeⅠ; C.crudeRadixpolygalaeⅡ; D.honey processedRadixpolygalae

3讨论

CAD检测器作为一种新型通用检测器，检测信号不依赖被检测物质的化学结构，对不同结构的化合物有统一的响应[10]。现已应用于皂苷、糖、脂质和多肽等样品的检测[11]。与紫外和蒸发光散射检测器相比，CAD检测器对皂苷类成分的检测分析更加灵敏、准确和稳定[12]。对于CAD检测器，流动相中磷酸浓度过高，会造成基线噪音增大。因此，本实验选择了0.3 mL·L-1磷酸溶液作为流动相。CAD作为质量型检测器，可以通过适当增大进样体积来检测低浓度样品，或进行柱后有机相补偿，提高化合物的响应，降低定量检出限[13]。本实验建立了HPLC-CAD测定远志药材中细叶远志皂苷的含量测定方法。经过线性、稳定性、重复性、精密度和加样回收等方法学考察，结果表明本方法准确度高，精密度、重复性较好，质量浓度在1.0～10.0 mg·mL-1范围内，线性相关较好(r=0.999 9)，可作为药物及制剂中细叶远志皂苷的含量测定方法，对皂苷类化合物及其类似化合物的测定具有参考价值。

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Determination of tenuifolin inRadixpolygalaeby HPLC-CAD

LIU Ke，LIU Ligen*(Department of Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicine，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a high performance liquid chromatographic with charge aerosol detection (HPLC-CAD) method for the determination of tenuifolin in Radix polygalae. Methods Ultimate XB-C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm) was used in the study and the column temperature was 25 ℃，and methanol-0.3mL·L-1phosphoric acid (60︰40) solution as the mobile phase with a flow rate at 1 mL·min-1;the injection volume was 10 μL；CAD:nebulization temperature was 25 ℃ and collection frequency was 10 Hz．ResultsThe equation of linear regression was Y=4.295 4X-0.135 8，r=0. 999 9(n=6)，linear range was 1.0-10.0 mg·mL-1, and the average recovery was 101.4%. ConclusionThe method is accurate，rapid and high sensitive，which can be used in the quantitative determination of tenuifolin in protein pharmaceuticals．

Key words:Radix Polygalae；tenuifolin；HPLC-CAD；content

收稿日期：(2015-08-18)

通信作者：*刘利根，男，副研究员

作者简介：刘可，女，在读硕士研究生

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)01-0034-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.011