HPLC法测定痔速宁片中芦丁与没食子酸的含量

徐奇超，崔慧芳

(浙江省宁波市药品检验所，宁波　315048)



HPLC法测定痔速宁片中芦丁与没食子酸的含量

徐奇超，崔慧芳

(浙江省宁波市药品检验所，宁波315048)

摘要：目的建立HPLC法测定痔速宁片中芦丁与没食子酸含量的方法。方法采用Thermo Acclaim TM 120 C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-0.4 mL·L-1磷酸溶液，梯度洗脱；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为257和273 nm；进样量5 μL；柱温35 ℃。结果芦丁与没食子酸的线性范围分别为10.54～105.4 μg·mL-1(r=0.999 9，n=6)和51.075～510.75 μg·mL-1(r=0.999 9，n=6)；提取回收率分别为99.2%(RSD=0.7%，n=6)和99.4%(RSD=0.9%，n=6)。结论该方法简便、可靠、准确，可用于该制剂的质量控制。

关键词：痔速宁片；芦丁；没食子酸；HPLC

痔速宁片处方由白蔹、槐花、五倍子、黑豆、猪胆膏组成，能解毒消炎、止血止痛、消肿通便、收缩痔核，用于内痔、外痔、混合痔、肛裂等的治疗。其质量标准是卫生部药品标准，标准中无含量测定项[1]。目前有多篇关于采用高效液相色谱法测定芦丁、没食子酸含量[2-5]的报道，但未见采用高效液相色谱法同时测定芦丁与没食子酸的报道。为了更好地控制痔速宁片的质量，笔者建立了高效液相色谱法同时测定痔速宁片中槐花与五倍子的有效成分芦丁与没食子酸含量的方法。

1仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱(LC-20AT四元泵，SPD-M20A二极管阵列检测器，LC Solution 操作系统，日本岛津)；超声仪(SB25-12DTN，宁波新芝生物科技股份有限公司)；电子天平(CPA225D，德国Sartorius公司)；超纯水仪(法国Millipore公司)。

1.2试药甲醇(色谱纯，美国TEDIA天地试剂公司)；水为纯化水，其他试剂均为分析纯；痔速宁片(批号20140601，20140509，20140614，深圳市国盛源药业有限公司)；芦丁对照品(100080-200607)，没食子酸对照品(110831-200302)，均购自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Thermo Acclaim TM 120 C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相组成：甲醇(A)-0.4 mL·L-1磷酸溶液(B)，梯度洗脱：15%A(0 min)，15%A(5 min)，60%A(10 min)，60%A(15 min)，15%A(20 min)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：257与273 nm；进样量：5 μL；柱温：35 ℃。理论板数以芦丁计不低于5 000，芦丁和没食子酸与其他成分分离良好。

2.2溶液的配制

2.2.1对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品10.54 mg与没食子酸对照品20.43 mg，分别置于50和20 mL量瓶中，加甲醇适量超声溶解，定容，作为对照品储备液。精密量取芦丁储备液1.5 mL与没食子酸储备液2 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备取供试品10片，除去糖衣，研细，取约0.2 g，精密称定，置于25 mL量瓶中，加体积分数70%甲醇20 mL，超声处理30 min，放冷至室温，加体积分数70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液再经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3阴性溶液的制备按痔速宁片的处方，不加槐花与五倍子2种药材，依法制备阴性样品，按2.2.2项下供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

2.3线性关系考察精密量取芦丁与没食子酸对照品储备液各0.5,1.0,2.0,3.0,4.0和5.0 mL,置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀后按上述色谱条件进样，以峰面积(Y)对质量浓度(X，μg·mL-1)进行线性回归，得芦丁回归方程：Y=9 966.2X-3 291.4，r=0.999 9(n=6)；没食子酸回归方程：Y=15 437X-4 228.7，r=0.999 9(n=6)。结果表明,芦丁在进样量10.54～105.4 μg·mL-1、没食子酸在51.075～510.75 μg·mL-1范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.4专属性实验分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各5 μL，注入HPLC仪，色谱图见图1。可见芦丁与没食子酸峰形良好，理论板数大于5 000，表明处方中的其他成分对芦丁与没食子酸的测定无干扰。

2.5精密度实验取2.2.1项下的对照品溶液5 μL，按2.1项下的色谱条件，连续进样6次，记录其峰面积，测得芦丁与没食子酸峰面积RSD分别为0.8%和0.6%，结果表明，仪器精密度良好。

2.6重复性实验取同一批号(20140601)样品5份，按2.2.1项下方法平行制备5份样品溶液，分别按2.1项下色谱条件测定，分别测定色谱峰面积，芦丁与没食子酸的平均含量为1.12和7.04 mg·片-1，RSD分别为1.0%和1.2%。

2.7稳定性实验取同一样品溶液5 μL，每隔3 h进样一次，分别在0，3，6，9，12 h进样，测得芦丁与没食子酸峰面积的RSD分别为1.1%和0.9%。

图1HPLC图

A.对照品；B.样品；C阴性样品；1.没食子酸；2.芦丁

Fig.1 HPLC chromatograms

A．chemical reference substance；B.sample；C.blank sample；1.galic acid；2.rutin

2.8加样回收实验取已知含量的样品(批号20140601)约0.1 g，称取6份，精密称定，置于25 mL量瓶中，分别加入2种对照品溶液(芦丁0.210 8 mg·mL-1，没食子酸1.250 3 mg·mL-1)各1.5,2.0和2.5 mL，照样品测定项下测定，结果见表1。

表1 回收率实验结果

Tab.1 Results of the recovery test

(n=6)

注：芦丁平均回收率=99.23%，RSD=0.67%；没食子酸平均回收率=99.43%，RSD=0.94%

3讨论

3.1检测波长的选择利用二极管阵列检测器对芦丁与没食子酸对照品进行紫外扫描，分析其紫外吸收图谱，发现芦丁在257和354 nm处有最大吸收，没食子酸在215和273 nm处有最大吸收。经过比较发现，芦丁在257 nm处、没食子酸在273 nm处样品杂质峰吸收少，最后选择257和273 nm作为检测波长。

3.2流动相的选择参考相关文献[6-7]，本文曾实验多种不同比例的甲醇-0.4 mL·L-1磷酸溶液为流动相，但是所用时间较长，为了在相对较短的时间内获得满意的分离效果，故采用梯度洗脱，且供试品色谱图中主峰与相邻峰能够完全分离。

3.3提取溶剂的选择在实验过程中分别考察了以体积分数100%，70%，50%和30%甲醇作为提取溶剂，结果体积分数100%甲醇提取效果最差，其余3种溶剂相差不大，考虑到用0.45 μm微孔滤膜滤过时，体积分数70%甲醇最容易，而体积分数50%和30%甲醇因溶液黏度大不易滤过，故选择体积分数70%甲醇作为提取溶剂。

实验结果表明，此方法简便、可靠、准确，可用于该制剂的质量控制。

参考文献：

[1]WS3-B-1026-91，中华人民共和国卫生部药品标准.中药成方制剂[S].

[2]汤迎爽，康阿龙，宋红儒.高效液相色谱法测定痔速宁片中没食子酸含量[J].中国药业，2010，19(23):39-40.

[3]何建群，何晓艳，丁劲松.高效液相色谱法测定痔速宁片中芦丁含量[J].中南药学，2010，8(11):879-880.

[4]孙秋，高莹莹，常波.痔速宁片中芦丁的含量[J].中国医药指南，2011，9(34):304-305.

[5]王宾，王隶书.痔速宁片中芦丁的HPLC法测定[J].中国药师，2007，10(2)：149-150.

[6]周静，美丽万·阿不都热依木.HPLC法测定维药刺山柑种子中没食子酸和芦丁的含量[J].西北药学杂志，2014，29(2):117-119.

[7]张雅，曹蔚，谢艳华,等. HPLC法测定复方烧伤膏中没食子酸的含量[J].西北药学杂志，2012，27(5)：425-426.

Determination of rutin and galic acid in Zhisuning Tablets by HPLC

XU Qichao，CUI Huifang(Ningbo Institute for Drug Control，Ningbo 315048，China)

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of rutin and galic acid in Zhisuning Tablets. MethodsA Thermo Acclaim TM 120 C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)column was used.The mobile phase was acetonitrile-0.4 mL·L-1phosphoric acid solution by gradient elution；the flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 257 and 273 nm.The injection volume was 5 μL.The column tempereture was 35 ℃. ResultsThe linear range of rutin was 10.54-105.4 μg·mL-1，(r=0.999 9,n=6)，and galic acid range was 51.075-510.75 μg·mL-1，(r=0.999 9,n=6).The average recovery of rutin was 99.2%， (RSD=0.7%,n=6)，and galic acid was 99.4%，(RSD=0.9%,n=6). Conclusion The method is simple，reliable，accurate, and can be applied to the quality control of the preparation.

Key words:Zhisuning Tablets；rutin；galic acid;HPLC

收稿日期：(2015-04-01)

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)01-0029-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.009