一测多评法测定新疆药桑叶中4种活性成分的含量

朱卫敏，李　玲，孙　莲

(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 　830054)



一测多评法测定新疆药桑叶中4种活性成分的含量

朱卫敏，李玲，孙莲*

(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830054)

摘要：目的采用一测多评法测定新疆药桑叶中的4种活性成分的含量。方法采用HPLC测定新疆药桑叶中4种成分的含量，流动相5 mL·L-1磷酸水溶液(A)-乙睛(B)梯度洗脱(0～8 min，80%～85% A；8～20 min，80% A；20～30 min，80%～95% A); 检测波长：344 nm。选择芦丁为内标物，测定其与紫云英苷、异槲皮苷和绿原酸的相对校正因子，计算新疆药桑叶中4种成分的含量，并比较一测多评法的计算值与外标法实测值的相似度。结果一测多评法和外标法测得的绿原酸、异槲皮苷和紫云英苷的含量相似度均达到0.999。结论建立的一测多评法适用于新疆药桑叶中4种成分的含量测定，相对校正因子可靠。

关键词：药桑叶；一测多评法；HPLC；相对校正因子

桑叶为桑科植物桑(Morusalbal)的干燥叶，性寒、味甘、苦，具有疏散风热、清肝明目、清肺润燥等功能[1]。《本草纲目》中记载，桑叶“煎汁代茗，能止消渴”“炙熟煎饮，代茶止渴”，自古就是常用中药之一[2]。现代研究表明，桑叶具有降血压、降血糖、降血脂、抗凝等多种药理作用，其化学成分主要有黄酮、生物碱、氨基酸等。其中黄酮是其主要有效成分之一，具有降血糖、降血压、防止动脉硬化、抗衰老、清除人体内超氧离子自由基等生理活性[3-4]。新疆药桑叶主产于新疆南部的和田、喀什、阿克苏等广大地区，具有十分重要的药用价值。因此分析测定药桑叶中的多种有效成分对开发利用新疆药桑叶资源具有重要意义[5-7]。

采用一测多评法(Quantitative analysis of multicomponents by single-marker，QAMS)，测定新疆药桑叶中芦丁、异槲皮苷、绿原酸、紫云英苷含量的文献还未见报道。一测多评法是采用1个对照品来实现对多种成分的同步测定，对于一些制备困难或价格昂贵的对照品具有实际的应用价值[8]。该法也被2010年版《中国药典》采纳。本研究应用一测多评法对新疆药桑叶中多种成分进行质量控制，即以芦丁对照品为内标物，通过建立其与绿原酸、异槲皮苷、紫云英苷的相对校正因子(Relative correction factor，RCF)进行含量计算，以降低检测成本和时间，验证方法的实用性，为药桑叶的质量控制提供参考和依据。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent 1220高效液相色谱仪(Agilent，美国)；Waters 2695高效液相色谱仪(waters，美国)；超声清洗仪(KQ5200DE型，昆山市超声仪器有限公司)；分析天平(Mettler-Teledo，AB135-S，d=0.01/0.1 mg)。

1.2试药芦丁(批号100080-200707)、绿原酸(批号110753-200910)、异槲皮苷(批号111809-201102)和紫云英苷(批号114201-200908)均由中国药品生物制品检定所提供；乙睛为色谱纯(Merck公司)；磷酸为优级纯(成都市科龙化工试剂厂)；药桑叶药材采自于新疆和田、喀什和库尔勒等地区，经新疆医科大学生药学教研室帕丽达·阿不力孜教授鉴定为药桑叶。

2方法与结果

2.1色谱条件依利特-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：5 mL·L-1的磷酸水溶液(A)-乙睛(B)梯度洗脱(0～8 min，80%～85% A；8～20 min，80% A；20～30 min，80%～95% A)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：室温；进样量：20 μL；检测波长：344 nm；见图1。

图1HPLC图

A.对照品；B.样品；

1.绿原酸；2.芦丁；3.异槲皮苷；4.紫云英苷

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference standards；B.sample；

1.chlorogenic acid； 2.rutinoside；3.isoquercitrin；4.astragalin

2.2对照品溶液的制备依次精密称取芦丁5.02 mg，异槲皮苷5.04 mg，紫云英苷5.04 mg和绿原酸4.88 mg，用甲醇定容至5 mL，经0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.3供试品溶液的制备精密称取药桑叶粉末(过三号筛)2.50 g，加入20 mL甲醇(1∶8料液比)。超声提取(80 W)3次，每次25 min，过滤，滤液浓缩后定容至25 mL量瓶中，摇匀，经0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得。

2.4方法学考察

2.4.1精密度实验分别配制对照品芦丁(0.251 mg·mL-1)，绿原酸(0.488 mg·mL-1)，紫云英苷(0.056 mg·mL-1)和异槲皮苷(0.252 mg·mL-1)的混合对照品溶液，按照2.1项下的色谱条件连续进样6次。结果显示，芦丁、绿原酸、紫云英苷和异槲皮苷相对峰面积的RSD均<2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2重复性实验精密量取同一供试品溶液6份，按照2.1项下色谱条件测定，结果绿原酸、芦丁、异槲皮苷和紫云英苷的RSD在 0.24%～1.8%。

2.4.3稳定性实验取同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，12和24 h进样，按照2.1项下色谱条件测定，结果显示，绿原酸、芦丁、异槲皮苷和紫云英苷的RSD在1.2%～2.4%。

2.4.4加样回收率精密称取已知含量的同批样品2.50 g，6份，根据4种成分的含量精密加入各对照品，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，计算芦丁、绿原酸、紫云英苷和异槲皮苷的平均回收率分别为95.6%，99.9%，100.5%和96.0%。

2.5线性关系的考察分别吸取不同体积的芦丁、异槲皮苷、紫云英苷和绿原酸的储备液，用甲醇稀释至不同体积，制备成含4种成分的5个不同质量浓度的系列溶液，按照2.1项下色谱条件测定，以对照品的质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标，进行积分处理。各有效成分的回归方程及线性范围见表1。

表14种有效成分的线性方程

Tab.1 The linear equations of the four effective compositions

有效成分标准曲线线性范围/μg·mL-1r芦丁Y=27.632X-7.8576.3～100.41.0000绿原酸Y=47.598X-58.71712.2～292.80.9991异槲皮苷Y=40.169X-8.60356.3～126.00.9999紫云英苷Y=5.077X-11.28810.1～201.60.9999

2.6相对校正因子选择芦丁为内标物，按照公式fkm=fk/fm=Wk×Am/(Wm×Ak)，式中Ak为内标物的峰面积，Wm为内标物的质量浓度，Am为其他组分m的峰面积，Wm为其他组分m的浓度。分别计算绿原酸、异槲皮苷和紫云英苷的校正因子，分别记为f绿/芦，f异/芦和f紫/芦，结果见表2。

表2药桑叶中3种成分对芦丁的相对校正因子

Tab.2 The RCF of astragaline，isoquercitrin and chlorogenic acid to rutin

进样体积/μLf绿/芦f异/芦f紫/芦11.6911.4380.1782.51.6891.4520.17951.7171.4600.18171.7201.4620.18281.7231.4510.183平均值1.7081.4530.181RSD0.9700.6501.150

2.7耐用性和系统适用性考察取2.2项下的各对照品溶液，分别进样5次，每次进样5 μL，考察2种高效液相色谱仪和3种色谱柱：依利特-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Shim-pack-ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，结果见表3～4。

表3不同色谱仪和色谱柱测得的药桑叶中3种有效成分的相对校正因子

Tab.3 The RCF of different column chromatography and determination of three kinds of effective components inMorusningra

高效液相色谱仪色谱柱f绿/芦f异/芦f紫/芦Waters-e2695AgilentSB-C18柱1.6921.4650.185Agilent1220依利特-ODS色谱柱1.7081.4530.181Shim-pack-ODS柱1.7061.4540.185AgilentSB-C18柱1.6941.4740.187平均值1.7001.4620.185RSD0.5000.7001.400

表4药桑叶中各组分的保留时间

Tab.4 The retention time of each component inMorusningra

高效液相色谱仪柱t绿/芦t异/芦t紫/芦AgilentSB-C18柱0.50201.13051.5890依利特-ODS色谱柱0.49461.14201.6060Shim-pack-ODS柱0.50351.12591.5800AgilentSB-C18柱0.50201.13011.5900

表5药桑叶中各成分的一测多评法与外标法结果

Tab.5 The results of each component ofMorusningraby external standard method and QAMS

样品芦丁绿原酸紫云英苷异槲皮苷外标法一测多评外标法一测多评外标法一测多评10.88112.08402.10680.77310.74810.43210.429120.44500.90010.90460.63800.61470.32000.318430.45711.01621.02460.55410.53310.30010.298341.07322.51232.53910.97720.95030.53020.526150.43100.83410.83760.62430.60010.31800.315560.98812.22102.24340.97510.94960.53910.535670.31210.45310.45160.43400.41220.29420.293981.17801.96321.98181.40711.37860.97110.966490.47101.10801.11780.98920.96530.44700.4457100.60010.66910.66931.49701.47150.61300.6105

经过查阅文献，评价2组数据贴近程度的方法主要有夹角余弦法、相关系数法、相似度法、模糊分布法和模糊欧氏距离法等[9-10]。分别选用夹角余弦值法、相关系数法和相似度3种方法对表5中2组数据进行分析，比较2种方法测得结果的差异性，验证一测多评法应用于多指标成分含量测定的准确性。

夹角余弦法计算公式：

相关系数计算公式：

相似度法计算公式：

本文采用相似度法、夹角余弦值法、相关系数法、计算外标法与一测多评法测得的绿原酸、紫云英苷和异槲皮苷的含量相似度均为0.999，表明2种方法测得的其他3种成分的含量无显著性差异。

3讨论

芦丁为新疆药桑叶的主要有效成分之一，且其对照品容易制备，价格低廉，故被选为内标物，利用一测多评法来测量新疆药桑叶中其余3种有效成分(价格较昂贵)的含量；在确定药桑叶提取方法时考察了不同的提取溶剂(乙醇、甲醇)，并用正交法对其提取时间、提取功率、料液比和提取次数进行考察，得出的最优条件是以甲醇为提取溶剂，按照1︰8的料液比提取3次、每次提取25 min、提取功率为80 W；在建立芦丁与其余3种有效成分的相对校正因子时，考察了不同的液相色谱体系、不同色谱柱的影响。结果表明，一测多评法与外标法测得的含量之间无显著性差异，说明建立的相对校正因子具有较好的可信度，也说明一测多评法可作为在对照品难以得到的情况下实现对新疆药桑叶多指标成分进行定量分析与质量控制的方法。

参考文献：

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Determination of four active ingredients inMorusningraby quantitative analysis of multi-components with a single-marker

ZHU Weimin，LI Ling，SUN Lian*(School of Pharmacy, Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a quantitative method with a single-marker(QAMS) for determining the contents of four ingredients in Morus ningra. Methods The contents of 4 ingredients in Morus ningra were determined by HPLC using a mobile phase of 5 mL·L-1phosphoric acid solution (A)-acetonitrile(B) with a gradient elution program (0-8 min，80%-85% A;8-20 min，80% A;20-30 min，80%-95% A)，detection wavelength:344 nm.With rutin as an internal standard，the relative correlation factors (RCF) of astragaline，isoquercitrin and chlorogenic acid to rutin were calculated. The contents of these four ingredients were determined by the external standard method and QAMS，respectively. Results These 2 methods did not show significant difference in assay results with similarity of 0.999.ConclusionQAMS could be used for the quality control of Morus ningra.

Key words:Morus ningra；quantitative analysis of multi-components with a single-marker；HPLC；relative correlation factor

收稿日期：(2015-06-15)

通信作者：*孙莲，女，教授，硕士生导师

作者简介：朱卫敏，女，在读硕士研究生

基金项目：新疆医科大学创新 (编号：XJC201316)

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)01-0015-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.005