不同切胚方式对玉米成熟胚愈伤组织诱导的影响

2016-01-18王洪振冉秋菊李秀玲包朝亚李长有姚洪源

种子 2016年3期

王洪振，陈徐，王姝，冉秋菊，李秀玲，包朝亚，李长有，姚洪源

（1．吉林师范大学生命科学学院，吉林四平136000；2．吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，长春130012；3．四平市神农种业有限公司，吉林四平136000）

玉米（Zea mays L．）的组织培养研究是玉米生物技术育种的基础，当前玉米幼胚的组织培养已经得到广泛应用。不同于玉米幼胚，玉米成熟种子容易保存，没有生长季节和数量限制，是适用于玉米组织培养的一种较理想的外植体。因此，玉米成熟胚组织培养的研究一直备受关注。Green等于1974年首次报道玉米成熟胚组织培养获得愈伤组织，但没有获得再生植株［1］。Wang等于1987年报道利用玉米成熟胚组织培养得到再生植株［2］。Huang等于2004年以7个玉米优良自交系种子为材料，建立了再生频率为19．8%～32．4%的成熟胚再生体系［3］。2008年，王世玉等进一步报道以玉米自交系CML 295、CML 304和18－599R的成熟胚为外植体，探讨并优化了成熟胚来源的胚性愈伤组织诱导及继代培养方法。对其愈伤组织的形态和组织切片的研究结果显示，继代过程可产生良好的Ⅱ型胚性愈伤组织。在分化培养中分别获得68．6%、75．4%和84．8%的高频再生率［4］。此后，越来越多的研究者相继报道以玉米成熟胚为外植体的组织培养取得成功［5－9］。

目前，由于外植体预处理环节在玉米成熟胚组织培养中没有统一的程序，不同的实验室采用的方法也不一样。本实验室进行了玉米成熟胚组织培养种子消毒条件优化及成熟胚愈伤组织诱导培养基优化研究，在此基础上，进一步研究不同切胚处理对玉米成熟胚愈伤组织诱导的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1．1 材料

1）实验材料：为玉米（Zea mays）种子平育2B。

2）试剂：MS培养基成分、无水乙醇等均为市售分析纯试剂，次氯酸钠溶液有效氯含量为10%，用蒸馏水稀释5倍即为本实验所用2%次氯酸钠溶液，现用现配。

3）仪器设备：电子天平（ACCULAB ALC－110．4），德国 Sartorious集团；立式蒸汽灭菌器（YXQ－LS－50SⅡ），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；超净工作台（DL－CJ－2ND型），北京东联哈尔仪器制造有限公司；智能光照培养箱（PGX 450D型），宁波海曙赛福实验仪器厂。

1．2 方法

1．2．1 玉米种子预处理

挑选成熟玉米种子，大小均匀饱满，用清水冲洗后，先用75%乙醇消毒1min，再用2%次氯酸钠溶液消毒8min，然后放入无菌50mL三角瓶中，每瓶20粒种子，加入无菌水浸泡处理72h。

1．2．2 切胚处理

将经过浸泡处理的成熟玉米种子，于超净台中进行无菌操作，用解剖刀剥离出成熟胚，盾片面朝上全胚接种在诱导培养基上，实验中所用诱导培养基全部为K 3玉米成熟胚愈伤组织诱导培养基［10］。

本实验设计4种不同玉米成熟胚切胚处理方式，玉米成熟胚全胚培养作为玉米成熟胚切胚处理的对照。

切胚处理Ⅰ：将成熟胚纵向切开，将半胚切口朝下接种于诱导培养基；切胚处理Ⅱ：将成熟胚先纵向切开，再横切1次，将四分胚切口朝下接种于诱导培养基；切胚处理Ⅲ：将成熟胚先纵向切开，再横切3次，将八分胚切口朝下接种于诱导培养基；切胚处理Ⅳ：用解剖刀将成熟胚从种子上剥离后，先纵向切开，再横切5次，将十二分胚切口朝下接种于诱导培养基。将培养皿放在培养箱中暗培养，温度为26℃。每天观察外植体的生长情况，及时去除污染的培养皿。3周后，进行成熟胚愈伤组织诱导率统计，并继代培养。

成熟胚愈伤组织诱导率（%）＝诱导出愈伤组织的成熟胚数／接种的成熟胚总数×100%。

2 结果与分析

玉米成熟胚全胚培养和4种不同切胚培养，分别统计成熟胚愈伤组织诱导率，结果如表1和图1。4种切胚处理中，切胚处理Ⅱ愈伤组织诱导率最高。

表1 4种切胚方式对玉米平育2B成熟胚愈伤组织诱导率的影响

图1 4种切胚方式对玉米平育2B成熟胚愈伤组织诱导率的影响

3 讨论

玉米成熟胚组织培养的预处理包括多个环节，如消毒、浸泡和变温处理等，每个环节都对愈伤组织的诱导、继代和再生有重要影响。

切胚处理也是玉米成熟胚组织培养预处理的一个重要步骤。目前关于玉米成熟胚组织培养的研究中，早期大多数采用全胚为外植体［11－13］。近期的研究中采用二分胚（胚纵切1次）为外植体的报道较多［14－16］。朴莲玉等分离出经过消毒和浸泡后种子的玉米胚，并将三分胚作为外植体［17］。赵锦慧等设计了4种切胚方式：Ⅰ是将完整的全胚放于诱导培养基上；Ⅱ是将胚取出切去幼芽和幼根以后，再放置于诱导培养基上；Ⅲ是将去除幼根与幼芽的胚沿胚轴纵切以后分为两部分，切口紧贴培养基放置；Ⅳ是将Ⅲ处理的每部分再横着分割1次，最终切割为4块。结果表明，以上4种处理中，Ⅲ的处理方式下平均诱导率最高，而Ⅰ处理方式下平均诱导率最低，表明一定的损伤反而可以刺激外植体的诱导［18］。但其没有深入研究八分胚和十二分胚对愈伤组织诱导率的影响。

本实验在优化玉米成熟胚种子消毒条件和愈伤组织诱导培养基的基础上，设计了4种切胚处理方式，包括八分胚（胚纵切1次，再横切3次）和十二分胚（胚纵切1次，再横切5次）的实验。4种切胚方式结果表明，切胚处理Ⅱ（即四分胚）愈伤组织诱导率最高，这一实验结果与赵锦慧的实验结果相同，而切胚处理Ⅲ（即八分胚）和切胚处理Ⅳ（即十二分胚）的愈伤组织诱导率还没有作为对照的全胚培养的诱导率高。这一结果表明，虽然一定的损伤反而可以刺激愈伤组织的诱导，但外植体切割过小时对愈伤组织的诱导反而不利，接种的成熟胚外植体大小和损伤有一个合适的范围。本实验首次报道成熟胚切胚处理Ⅲ（即八分胚）和切胚处理Ⅳ（即十二分胚）对玉米成熟胚的愈伤组织诱导的影响，希望能够对以后的相关研究提供有价值的参考。

［1］Green C E，Phillips R L，Kleese R A．Tissue culture of maize（Zea mays L．）：initiation，maintenance and organic growth factors．Crop Sci，1974，14（1）：54－58．

［2］Wang A S．Callus induction and plant regeneration from maize mature embryos［J］．Plant Cell Rep，1987：360－362．

［3］Huang X Q，Wei Z M．High－frequency plant regeneration through callus initiation from mature embryos of maize（Zea mays L．）［J］．Plant Cell Rep，2004，22：793－800．

［4］王世玉，郑用琏，刘亚，等．玉米成熟胚胚性愈伤组织的诱导、高频再生及转化的研究［J］．作物学报，2008，34（3）：423－428．

［5］何婷，王亦菲，陆瑞菊，等．糯玉米的成熟胚培养［J］．中国农学通报，2009，25（4）：47－49．

［6］贾小霞，王汉宁，孔维萍，等．玉米幼胚和成熟胚愈伤组织诱导过程中内源激素的比较［J］．核农学报，2009，23（4）：555－560．

［7］肖莉杰，王丽艳，闵丽．玉米成熟胚愈伤组织的诱导［J］．农业科学与技术：英文版，2009，10（6）：67－68，93．

［8］孔维萍．利用正交试验筛选玉米成熟胚愈伤组织诱导培养基［J］．农业科技通讯，2010（1）：62－63．

［9］裴冬丽，李成伟，韩秀英，等．玉米成熟胚离体培养体系的建立［J］．玉米科学，2011，19（2）：77－79，83．

［10］王洪振，陈徐，黄二冲，等．玉米种子消毒条件的优化及成熟胚愈伤组织诱导研究［J］．吉林师范大学学报（自然科学版），2014，11（4）：91－94．

［11］郭丽红，陈善娜，龚明，等．玉米根尖和成熟胚的愈伤组织培养及悬浮系的建立［J］．云南大学学报（自然科学版），1999，21（1）：141－144．

［12］石太渊，杨立国，杜艳艳，等．玉米体细胞培养中不同基因型和外植体的反应［J］．国外农学杂粮作物，1999，19（5）：11－14．

［13］王昌涛，杨爱国，高树仁，等．玉米不同外植体愈伤组织的诱导及植株再生的研究［J］．沈阳农业大学学报，2005，10，36（5）：515－518．

［14］陈勋基，危晓薇，李建平，等．玉米自交系成熟胚愈伤组织诱导和再生体系研究［J］．新疆农业科学，2011，48（1）：30－34．

［15］邸宏，梁广东，张林，等．玉米自交系成熟胚再生体系的优化［J］．玉米科学，2011，19（1）：56－59．