3种草本植物种子萌发及幼苗初期对镉胁迫的生理响应

2016-01-18徐玲玲李巧玉张红莲罗德勇黎四现

种子 2016年3期

徐玲玲，李巧玉，张红莲，罗德勇，黎四现，关萍

（贵州大学生命科学学院，贵阳550025）

目前，由于人类过于频繁的生产活动导致的重金属污染已经成为全球环境治理的一大难题，由重金属造成的水体污染和土壤污染已经成为全球急待解决的问题。其中，镉污染不容忽视。镉是具有剧毒的重金属，具有极强的生物迁移性，土壤中的镉易被植物吸收，并最终通过食物链对动植物的生长和人类的健康构成了严重威胁［1］。据统计，我国大约有1／5的耕地面积遭到重金属污染，严重减少了农作物的产量［2］，所以由重金属引起的土壤修复正成为研究的热点。在众多的修复方法中，植物修复因其具有成本低、操作简便、对环境扰动较小和不易造成二次污染等优点受到研究者的青睐［3－4］；尤其是具有生态功能的花卉及牧草，既具有观赏价值，又能改善周边环境，还能在一定程度上增加植被的覆盖率［5］，所以对于这一类植物的筛选显得尤为重要。目前国内外已经发现的重金属超积累植物多达500多种，但大多是Ni的超富集植物，镉超富集植物数量较少［6］。对于耐镉植物的筛选，大多从成苗期开始，但始于种子萌发阶段的较少。种子萌发作为植物生活周期的关键阶段，在此阶段的生长状况直接与植物后期的生长和繁殖密切相关，所以，探讨种子萌发阶段和幼苗初期对重金属的生理响应显得更实际［7］。凤仙花是常见的花卉植物，紫云英是常见的牧草，韭菜具有易生长、生活周期长、生物量大的优点，3种植物均具有一定的生态功能。本试验初步探讨了凤仙花、韭菜和紫云英种子萌发阶段和幼苗初期对不同浓度镉的生理响应，以期为耐镉植物的筛选和重金属污染区的土壤修复提供一定的参考。

1 材料与方法

1．1 供试材料

供试种子为凤仙花（Impatiens balsamina L．）、韭菜（A tuberosum Rottl．ex Spreng）和紫云英（Astragalus sinicus L．），分别购买于山东临沂沃术花卉园、广东广州幸福种子百汇和浙江杭州鑫源花卉种子店。试剂：氯化镉（CdCl2·2．5H2O）为分析纯，蒸馏水；其他材料及仪器有：培养皿，光照培养箱，紫外分光光度计，高速冷冻离心机，电子天平，镊子，游标卡尺，定性滤纸等。

1．2 实验设计

分别将3种供试种子用0．5%高锰酸钾表面消毒5min，用自来水冲洗若干次，然后用蒸馏水冲洗数次，将种子浸泡于去离子水中24h后，将多余的水分倒掉，然后用滤纸将其表面的水分吸干。选取直径为11cm的培养皿，放入双层同等规格的定性滤纸，用5mL移液枪向其中加入等量的镉液直至滤纸饱和为止，然后在每个培养皿中用镊子加入种子50粒，种子之间的距离要适中，以保证每粒种子与培养液充分接触。本试验共设置7个处理，用CdCl2·2．5H2O分别配置成质量浓度为50，100，150，200，250，300mg／L的镉液，蒸馏水处理为对照，每个处理5个重复，以保证有足够的量进行生理指标的测定。将存有种子的培养皿放入25℃光照培养箱中培养，每隔1d向内补充相应等量的培养液，以维持皿内相对恒定的培养液浓度和湿度。每天观察记录种子的萌发状况，分别于第4天统计种子的发芽势，第7天统计发芽率，培养14d后，取幼苗进行各生理指标的测定。

1．3 测定内容与方法

1．3．1 种子萌发指标的测定

一般认为待胚芽长至种子长度一半时为萌发。种子萌发1d后，持续7d观察并记录其发芽数，于第4天统计发芽势，第7天统计发芽率，测定其根长、苗长，并计算其发芽指数以及活力指数。以下指标的计算参考孙园园［8］等的方法。

发芽率（%）＝供试种子的发芽数／供试种子数×100%。

发芽势（%）＝3d内供试种子的发芽数／供试种子数×100%。

发芽指数＝∑Gt／Dt，式中Gt为在t日的发芽数，Dt为发芽天数。

活力指数＝发芽指数×S，式中GI为发芽指数，S为芽的长度＋根的长度。

1．3．2 生理指标的测定

培养2周后，分别测定3种植物叶绿素、丙二醛（MDA）的含量，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的活性。叶绿素含量采用分光光度法测定［9］，MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定［10］，SOD 活性参照涂俊芳［11］等的氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定，CAT活性测定参照王亚玲［12］等的紫外吸收法测定，POD活性参照张志良［13］等的愈创木酚法测定。

1．4 数据分析

数据用 Microsoft Office Excel 2010进行整理，用SPSS（19．0）进行单因素方差分析，用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2．1 不同浓度镉对3种植物发芽势及发芽率的影响

当镉浓度在100～300mg／L时，3种植物各胁迫处理的发芽势和发芽率与对照均差异显著（p＜0．05）（表1）。在50mg／L镉胁迫下，发芽率均略高于对照，说明低浓度镉能促进种子萌发。在0～50mg／L镉处理范围内，发芽势与对照均没有显著差异（p＞0．05）。随着胁迫浓度增大，发芽势和发芽率均表现出下降的趋势，在300mg／L二者均降至最低，与对照差异极为显著（p＜0．01），说明高浓度镉抑制种子萌发。各处理下韭菜和凤仙花的发芽势和发芽率差别不大，但均低于紫云英的。在300mg／L镉浓度下，紫云英的萌发率仍然达到41．33%，说明镉对其萌发的影响小于韭菜和凤仙花。

表1 不同浓度镉对3种植物种子萌发的影响

2．2 不同浓度镉胁迫对3种植物幼苗初期生长的影响

3种植物在50mg／L镉处理时，苗长和根长均与对照有显著差异（p＜0．05）（表2）。在300mg／L，韭菜、凤仙花和紫云英的根长分别为 0．76，0．25，0．26 cm，苗长分别为2．39，1．27，0．75cm，均与对照具有极显著差异（p＜0．01）。根长和苗长除韭菜和凤仙花个别处理浓度间差异不显著外，基本上各植物在各处理浓度间差异显著，说明随着胁迫浓度的提高，镉对植株生长的阻碍作用越强。镉浓度为300mg／L时，植株根长及苗长均最短，甚至出现无根苗。

2．3 不同浓度镉胁迫对3种植物发芽指数和活力指数的影响

随着镉浓度的升高，3种植物的发芽指数均呈现出先升后降的趋势（图1）。在100mg／L镉处理下，凤仙花和紫云英的发芽指数达到最大值36．57，比对照增加了16．46%。随着胁迫浓度的增加，发芽指数逐渐下降。在300mg／L胁迫浓度下，3种植物的发芽指数均达到最小值，分别为13．6，15．33，20．6，比对照下降了56．69%，48．2%，55．08%。活力指数也随镉胁迫浓度的升高呈下降趋势（图2）。在300mg／L时活力指数最低，分别比对照下降了85．87%，92．64%，94．6%，差异极显著。

图1 不同浓度镉胁迫下3种植物的发芽指数

图2 不同浓度镉胁迫下3种植物的活力指数

2．4 不同浓度镉胁迫对3种植物叶绿素含量的影响

叶绿素含量在镉浓度大于50mg／L时，随胁迫浓度的升高呈下降趋势（图3）；韭菜和紫云英叶绿素的含量则随着胁迫浓度增加而下降，趋势较为平缓，而韭菜在前中期下降幅度不大，后期下降幅度较为明显。在300 mg／L镉浓度时，3种植物叶绿素含量均降到最低，分别为0．34，0．24，0．6mg／g （FW），分别较对照降低了57．5%、53．66%、48．24%。在300mg／L时，3种植物的叶片较对照明显发黄，紫云英和凤仙花根部出现黑色斑点，表明高镉胁迫明显影响植物叶绿素的合成。

2．5 不同浓度镉胁迫对3种植物幼苗MDA含量的影响

3种植物MDA含量均随着镉浓度的增加呈先升后降的趋势（图4）。凤仙花和韭菜在低镉浓度（50～100mg／L）胁迫下，MDA含量逐渐上升，并达到最大值1．01，0．88nmol／g （FW），分别较对照增加了40．6%、31．81%；紫云英 MDA 含量在200mg／L镉浓度胁迫下，达到最大值0．57nmol／g（FW），较对照增加了43．86%。3种植物MDA含量均在300mg／L镉胁迫下时达到最低值（0．44，0．43，0．21nmol／g（FW）），分别较对照下降了26．67%、38．33%、34．38%。同一镉浓度下，MDA含量高低顺序为：凤仙花＞韭菜＞紫云英。

表2 不同浓度镉对3种植物幼苗初期生长的影响

图3 不同浓度镉胁迫下3种植物的叶绿素含量

图4 不同浓度镉胁迫下3种植物的MDA含量

2．6 不同浓度镉胁迫对3种植物幼苗抗氧化酶活性的影响

2．6．1 镉胁迫对3种植物幼苗SOD活性的影响

紫云英和韭菜SOD活性呈现先升后降的趋势，凤仙花则表现出先降后升再降的趋势（图5）。前两者均在镉浓度为100mg／L时达到最大值118．04，136．22 U／g（FW），随着胁迫浓度增加，SOD活性逐渐降低，在300mg／L镉浓度时，降至最低，分别为97．87，70．92 U／g（FW）。凤仙花SOD活性在50mg／L镉浓度较对照低，说明低浓度的胁迫对其没有造成损伤；随着胁迫浓度的增加，活性开始增强，并在150mg／L镉浓度时达到最大值82．33U／g（FW），当镉浓度为250mg／L时，开始低于对照组。3种植物SOD活性均在镉浓度为300mg／L最低，且都低于对照组。

2．6．2 不同浓度镉胁迫对3种植物幼苗CAT活性的影响

3种植物CAT活性均呈现先升后降的趋势，韭菜增幅明显大于凤仙花和紫云英（图6）。韭菜和凤仙花在250mg／L镉处理下，CAT活性达到最大值，为5．65，1．89U／（g·min）（FW）；紫云英 CAT活性在镉浓度为100mg／L时达到最大值4．49U／（g·min）（FW）。在300mg／L镉处理下，凤仙花CAT活性降至1．22U／（g·min）（FW），仍然较对照高，而韭菜和紫云英CAT活性则达到最低值，分别为3．07，1．88U／（g·min）（FW），均比对照低，说明3种植物对镉胁迫的应激程度存在差异。

图5 不同浓度镉胁迫下3种植物的SOD活性

图7 不同浓度镉胁迫下3种植物POD活性变化

2．6．3 镉胁迫对3种植物幼苗POD活性的影响

凤仙花和韭菜POD活性均呈现先升后降的趋势，而紫云英呈上升的趋势（图7）。前二者POD活性分别在200，250mg／L镉浓度下达到最大值90．93，66．24U／（g·min）（FW），分别比对照增加了59．94%、84．44%，差异显著；随着胁迫浓度的进一步增大，二者POD活性开始迅速下降，并在300mg／L镉胁迫下降至44．48，35．15U／（g·min）（FW）。而后者 POD活性在300mg／L镉处理浓度下达到最大值115．87U／（g·min）（FW）。3种植物POD活性即使在300mg／L镉胁迫下，依然高于对照，说明它们对镉具有一定的耐受性。

3 讨论

不同植物对重金属胁迫的生理响应不尽相同，原因可能与植物本身对重金属的耐性不同有关，这与牛雅典［14］对不同油菜品种的耐性研究结果类似。对种子萌发和幼苗生长而言，很多重金属表现出低促高抑的现象［15－17］。本试验中，韭菜、凤仙花和紫云英的发芽率和发芽势随着镉胁迫浓度的提高均显著下降，有学者认为这与镉能抑制与植物萌发有关酶类的活性或者阻碍细胞分裂有关［18］。高浓度镉对根长与芽长的影响极为明显，且对根的抑制作用大于芽的，这与蓝群［19］等的研究相符。活力指数综合反映了重金属对种子萌发的影响［20］，本试验中活力指数比发芽指数下降趋势更明显，说明镉严重抑制种子萌发。有研究表明，重金属通过抑制叶绿素的合成降低细胞内叶绿素的含量，从而影响植物的光合作用［21］。本试验中，叶绿素含量大体上与镉浓度呈负相关，说明高浓度重金属抑制了叶绿素的合成。MDA是细胞膜膜脂过氧化的直接产物，其含量在一定程度上反映了植物抵御逆境的能力［22］。3种植物 MDA含量呈先升后降的规律，说明植物只在一定范围的逆境中具有抵抗能力，超过这一范围，就会失去自身的抵御能力。植物在逆境中往往通过启动自身的抗氧化保护酶系统来减少或清除由逆境产生的活性氧，以减轻逆境带来的伤害。3种植物的SOD、POD、CAT活性均表现出先升后降的趋势，在某个特定的镉胁迫强度内，保护酶产生的作用大于活性氧的作用，植物未表现出受害现象，但当胁迫强度超过植物所能承受的范围，保护酶系统的作用不足以抵抗活性氧的作用，植物调控失败，代谢紊乱，甚至死亡。这与常云霞［23］等人的结论一致。不同浓度镉胁迫对韭菜、凤仙花和紫云英种子萌发和幼苗初期生理特性的影响表明，3种植物对镉耐受性存在差异，但对于造成这种差异的原因还需要做进一步的研究。

［1］易泽夫，余杏，吴景．镉污染土壤修复技术研究进展［J］．现代农业科技，2014（9）：251－253．

［2］谭长银，余霞，邓楚雄，等．镉污染土壤的植物修复及修复植物的能源利用潜力［J］．经济师，2011（8）：52－53．

［3］赵磊，罗于洋．我国草本植物中重金属富集、超富集植物筛选研究进展［J］．内蒙古草业，2009（1）：43－47．

［4］高陈玺，李川，彭娟，等．植物提取修复矿区重金属污染土壤研究现状［J］．重庆工商大学学报（自然科学版），2013（4）：55－58，71．

［5］王庆海，却晓娥．治理环境污染的绿色植物修复技术［J］．中国生态农业学报，2013（2）：261－266．

［6］郭彬，李伟东，丁能飞，等．重金属污染土壤的植物修复技术的问题及对策［J］．浙江农业学报，2013（4）：852－857．

［7］张春荣，李红，夏立江，等．镉、锌对紫花苜蓿种子萌发及幼苗的影响［J］．华北农学报，2005（1）：96－99．

［8］孙园园，张光兰，杨文杰，等．镉胁迫对1年生黑麦草种子萌发及幼苗初期生理生化特性的影响［J］．种子，2014，33（8）：25－29．

［9］郝建军．植物生理学试验技术［M］．沈阳：辽宁科学技术出版社，2004．

［10］李合生．植物生理生化实验原理和技术［M］．北京：高等教育出版社，2000：260－261．

［11］涂俊芳，王兴明，刘登义，等．不同浓度铜对紫背萍和青萍色素含量及抗氧化酶系统的影响［J］．应用生态学报，2006（3）：3 502－3 506．

［12］王娅玲，李维峰，杜华波，等．铅胁迫对咖啡幼苗叶绿素含量及抗氧化酶活性的影响［J］．贵州农业科学，2014（2）：56－58．