茶皂苷的超声波提取及抗真菌作用研究

夏晓萍俸春红叶 红郑彩虹刘龙孝

（1.浙江大学药学院；2.浙江大学医学院附属妇产科医院；3.中国农业科学院茶叶研究所）

茶皂苷是来源于山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）植物茶（Camellia sinensis L.）的果实（茶籽）中的一类三萜皂苷。根据研究表明，茶籽中的皂苷是实现其药理作用的主要成分。茶皂苷属五环三萜皂苷，由苷元、糖体和有机酸三部分组成，糖体连接在3位碳的取代基上。苷元系齐墩果烷型，由苷元母核及取代基组成。基本结构如图1。

图1 茶皂苷的苷元母核结构

茶皂苷提取法主要是水提法和有机溶剂法，本文在传统的有机溶剂提取法基础上，应用超声提取工艺，采用L9(34)正交试验设计考察提取溶剂乙醇浓度、液料比、温度和超声时间对茶皂苷提取得率的影响，优选出最佳提取方案。以高效液相色谱法测定茶皂苷含量。近年来，茶皂苷药理作用成为研究的热点，有学者报道茶皂苷有抗菌作用，民间也有将茶籽饼粕用于治疗皮肤病的经验方。本文考察茶皂苷对临床常见的致病性真菌（念珠菌）的体外抗菌活性。

一、材料与方法

1.仪器与材料

（1）实验材料

茶籽系2014年11月采摘自浙江杭州龙井种(Camellia sinensis cv.Longjing)的成熟果实。茶皂苷对照品：中国农业科学院茶叶研究所提供(茶皂苷纯度≥95%)。RPMI—1640培养基(含L-谷酰胺而不含碳酸氢钠，含pH指示剂)（上海生工生物）；科玛嘉显色培养基（郑州博赛生物技术有限公司）；沙保培养基（SHAB-101101）(法国生物梅里埃)；吗啉基丙磺酸（MOPS）（上海生工生物）。甲醇（色谱纯，PROLABO）其余试剂均为分析纯。

（2）试验菌株

念珠菌30株：包括标准质控菌株6株：其中白色念珠菌4株（ATCC64548,ATCC90029,ATCC64550,ATCC10231）；近平滑念珠菌 1株（ATCC22019）；克柔念珠菌 1株（ATCC6258）。临床分离株24株：其中白色念珠菌（Candida albicans）12株；光滑念珠菌(Candida glabrata)6株；克柔念珠菌(Candida krusei)3株；近平滑念珠菌(Candida krusei)3株。（标准菌种由中国药品生物制品鉴定所提供、临床分离株由浙江大学医学院附属妇产科医院临床分离)。

（3）试验设备与仪器

Agilent HP1100型高效液相色谱仪；超声波清洗机（USC-702，江苏昆山超声仪器有限公司）；水浴恒温振荡器（DSH2-300，江苏太仓试验设备厂）；冷冻干燥机（VIRTIS）；生物安全柜（The Baker Company）；全自动微生物分析仪(VITEK-Compact,法国生物梅里埃)；漩涡混合器（VORTEX-GENIE2）；生化培养箱 (上海精宏实验设备有限公司)

2.试验方法

（1）茶皂苷的提取

茶籽脱壳、干燥、粉碎至40目筛，得浅黄色茶籽粉末。乙醚脱脂，干燥得脱脂茶籽粉。取一定量的脱脂茶籽粉按特定比例的料液比，加入乙醇溶液，超声提取；超声功率300W，超声频率40KHZ。过滤，滤液减压回收溶剂，冷冻干燥，得茶皂苷提取物。

（2）超声辅助提取茶皂苷的单因素试验、正交试验及验证试验

以80%乙醇、料液比1∶10，超声提取时间20min,提取温度30℃，超声功率300W，超声频率40KHZ的提取参数为基础，以茶皂苷提取得率为考察指标，依次进行乙醇浓度、料液比、提取时间、温度的单因素试验，分析各因素对提取得率的影响，进行正交试验，并对正交试验最优组合进行验证。

（3）茶皂苷检测方法

高效液相色谱法检测。

a.标准曲线的制作

精密称取0.1g茶皂苷对照品，置于100mL容量瓶，加适量流动相，超声溶解，稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。色谱柱：Agilent Zrobax SB-C18柱（4.6mm×150mm,5μm）；流动相：甲醇-水（88：12）；流速：0.8mL/min；检测波长：280nm；柱温：25℃；进样量：10μ L。分别精密移取对照品样储备液适量，用流动相稀释成浓度20μg/mL,40μg/mL,80μg/mL,160μg/mL，320μg/mL,640μg/mL系列浓度，记录色谱峰面积。茶皂苷是由多种三萜类物质组成的混合物，对照品的浓度与峰响应值成线性，以对照品浓度X（μg/ml）对应的峰面积Y制定标准曲线，外标法定量测定茶皂苷含量。

b.茶皂苷测定

精密称取茶皂苷提取物0.1g，置于100mL容量瓶用流动相溶解，移取5mL，稀释至50mL即得供试液。供试液过0.45μm滤膜后进样。每个样品平行制备3份供试品。在上述的色谱条件下，测定峰面积，计算茶皂苷含量。

c.茶皂苷提取得率计算

茶皂苷提取得率（%）=茶皂苷质量／脱脂茶籽粉质量×100%。

（4）抗真菌作用研究

采用美国国家临床实验室标准化委员会（CLSI）制定的酵母菌（M—27A）方案测定抗念珠菌活性。

a.试药稀释

先配制高浓度贮存液。实验时，再以RPMI液体培养基稀释成终浓度的2倍。其终浓度分别为1269.76µg/mL，634.88µg/mL，317.44µg/mL，158.72µg/mL， 79.36µg/mL，39.68µg/mL，19.84µg/mL，9.92µg/mL，4.96µg/mL。

b.试验培养基

按CLSI方案的要求采用RPMI—1640培养基。称取RPMI—1640粉10.4g，MOPS34.53g，加入去离子水900mL，用1M NaOH调pH7.0(25℃),定容至1L。MOPS终浓度为：0.165mol/L,0.22µm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

c.菌悬液制备

念珠菌在沙保培养基上连续转种2次，以确保纯度和活力。经28℃培养48h,取5个直径大于1mm的菌落于5mL无菌生理盐水中震荡15s，制成菌悬液。用血细胞计数板将其浓度调至菌浓度为1～5×106CFU/mL。然后用RPMI液基1∶50稀释后再1∶20稀释，（即共稀释1000倍），至菌浓度1～5×103CFU/mL。

d.接种、培养

取微孔96孔板，1～9列孔中由高浓度至低浓度分别加0.1mL药液，再加0.1mL菌悬液。11号孔加0.2mL菌悬液（阳性孔）,12号孔加0.2mL空白对照。（不加药物的液基）。

药敏板用塑料包裹后，念珠菌35℃培养48h。观察结果。

e.结果判读

按照CLSI制定的标准进行结果判读。最小抑菌浓度(MIC)为肉眼直接观察到的真菌生长的完全被抑制时的药物浓度。在一批实验中，所有被测菌株得到的MIC值为MIC范围；能抑制50%或80%受试菌所需的MIC值，分别为MIC50值和MIC80值。

二、结果与分析

1.标准曲线的制定和精密度试验

按色谱条件对照样系列溶液进样分析,分别以对照样系列溶液的峰面积为纵坐标,以对照品样系列溶液的质量浓度X（μg/mL）,绘成标准曲线对峰面积Y进行线性回归，得回归方程：X=0.239Y-14.336，r=0.9998。结果表明在浓度20～640μg/mL范围内呈良好的线性关系。

精密度试验：取160μg/mL的对照品溶液，连续进样6次，记录保留时间和峰面积，RSD（n=6）分别为1.97%和1.73%。

重现性试验：取制备的茶皂苷提取物，共6份，平行制备供试液，进样体积10μL，记录色谱峰面积，RSD为2.95%（n=6）

2.单因素对茶皂苷提取得率的影响

(1)温度对茶皂苷提取得率的影响

分别选择30℃、40℃、50℃、60℃和70℃ 5个温度,以80%乙醇为提取溶剂，料液比1∶10，超声时间20min，超声功率300W，超声频率40KHZ为参数。考察温度对茶皂苷提取得率的影响。图2A显示：温度升高有利于茶皂苷的提取，但当温度升至70℃的提取得率与温度60℃的相比，无统计学差异，且温度过高，易引起茶皂苷结构的变化。因此，选择40℃、50℃、60℃作为正交试验因素水平。

(2)乙醇浓度对茶皂苷提取得率的影响

分别选择50%、60%、70%、80%、90%乙醇水溶液5个浓度提取溶剂，以料液比1∶10，超声时间20min，超声功率300W，超声频率40KHZ为参数，考察不同浓度的乙醇提取溶剂，对茶皂苷提取得率的影响。图2B显示：随着提取溶剂含水量增加，茶皂苷提取得率增加。80%乙醇的茶皂苷提取得率显著高于90%乙醇（P＜0.01）；70%乙醇茶皂苷提取得率高于80%的乙醇提取得率（P＜0.05）；但60%乙醇和70%乙醇的茶皂苷提取得率无统计学差异。且当乙醇浓度为60%时，茶皂苷提取得率较高但杂质增加。故选择70%、80%、90%乙醇作为正交试验的因素水平。

(3)超声时间对茶皂苷提取得率的影响

提取时间分别选择 10 min、20 min、30 min、40 min、50min，以80%乙醇为提取剂，料液比1∶10，超声功率300W，超声频率40KHZ为参数。考察超声时间对茶皂苷提取得率的影响。图2C显示：初始，随着超声时间增加，茶皂苷提取得率随之增加，但时间超过30min，得率不增加。因此：选择20min、30min、40min为正交试验因素水平。

(4)料液比对茶皂苷提取得率的影响

分别选择1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30料液比，以80%乙醇作为提取溶剂，超声时间20min，超声功率300W，超声频率40KHZ为参数。考察不同料液比，对茶皂苷提取得率的影响。图2D显示：随着料液比提高，茶皂苷提取得率并没有相应增加。因此选择1∶10、1∶15、1∶20为正交试验因素水平。

3.正交试验

为了全面考察茶皂苷提取得率的影响因素，根据单因素试验结果，选取4因素3水平，即L9（34）正交表进行正交试验。试验因素见表1，L9（34）正交试验见表2，每个水平重复试验3次。通过极差比较和F检验法对正交试验结果进行方差分析，结果见表3。

图2 单因素对茶皂苷得率的影响

表2中的R值显示：4种因素对茶皂苷提取得率的影响程度依次为B＞A＞C＞D，其中B因素的影响远大于其他3种因素。超声提取茶皂苷的最佳方案：B1D2C3D3，即70%乙醇浓度，料液比1∶15，超声时间40分钟，提取温度60℃。

表3的F检验结果显示：乙醇浓度（B因素）、液料比（D因素）、超声时间（C因素）、提取温度（A因素）均对茶皂苷提取得率具有显著的影响。

表1 茶皂苷提取的正交试验设计因素及水平设置

表2 茶皂苷提取的L9（34）正交试验设计及结果

表3 茶皂苷提取的正交试验的方差分析

4.超声辅助提取茶皂苷最佳工艺检验结果

按优选的最佳工艺条件，提取茶皂苷并重复试验3次。结果为提取得率：18.06%，RSD：2.78%。提取得率大于正交试验中的组合。

5.茶皂苷体外抗真菌活性

微孔药敏板35℃培养48h。将每孔生长情况与阳性孔和空白对照孔相比较，可见阳性孔念珠菌生长良好，空白对照孔无念珠菌生长。茶皂苷对念珠菌体外抗菌活性见表4。结果显示：茶皂苷体外抗念珠菌活性显著。

表4 茶皂苷抗念珠菌活性 （µg/mL）

三、讨论

1.超声提取技术是利用超声波辐射产生的空化效应、机械振动、乳化作用、扩散作用等增加物质分子运动的频率和速度，增大溶剂的穿透力，加速目标成分进入溶剂，快速、高效提取细胞内容物。与传统的萃取提取技术比较，能显著地提高提取效率。本试验得到了较优的提取工艺参数：70%乙醇浓度，料液比1∶15，超声时间 40min，提取温度60℃，提取得率达18.06%；溶剂用量（料液比）显示并不与提取得率成正比。

2.念珠菌（假丝酵母菌）是引起真菌病中最常见的机会致病性真菌。念珠菌可引起浅部真菌感染，也会引起深部真菌感染。白色念珠菌在念珠菌属中最为常见，致病性最强。基于环境、气候因素，尤其是临床广谱抗生素、皮质类固醇、免疫抑制剂等的广泛使用，导致念珠菌感染临床高发。临床上现有的抗真菌药物如唑类抗真菌药、两性霉素B等在高效低毒、耐药性方面的评价不能令人满意。本试验研究结果显示：茶皂苷有较好的体外抗念珠菌活性，其中对光滑念珠菌的抗菌活性最强MIC80仅79.36µg/mL，白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌克的柔念珠菌MIC80值317.44µg/mL，茶皂素是山茶属植物重要活性成分，茶皂苷抗真菌活性显著，其药理活性值得进一步研究。