甘草种子发芽检验标准化研究

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(甘肃中医药大学， 甘肃 兰州 730000)

甘草是豆科甘草属植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根及根茎，又称乌拉尔甘草、胀果甘草(GlycyrrhizainflateBat.)或光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)[1]。甘草不仅在中医药中频繁使用，在食品、化妆品、烟草及畜牧业等领域也广泛应用。此外，甘草还有改良土壤，防风固沙和保护环境的作用[2]。近年来，由于市场需求量猛增，野生资源的过度采挖导致甘草产量和质量急剧下降，同时加速了我国北方荒漠化的扩展[3-4]。面对日益增加的市场需求和不断减少的甘草野生资源，人工栽培成为缓解这一矛盾的有效途径。但是甘草种皮致密，透水、透气性差，在自然状态下萌发率极低[5]。因此，对于甘草种子的研究主要为进行前处理破除休眠[5-8]。关于环境因子(如发芽温度、发芽床和光照)对甘草种子发芽影响的报道较少。本试验研究了甘草种子发芽温度、发芽床、光照因素以及种子发芽动态，旨在确定发芽的最佳条件，为制定甘草种子检验规程提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验所用的甘草种子采自酒泉市巨龙农业科技示范园，经甘肃中医药大学杜弢教授鉴定为豆科植物乌拉尔甘草的种子。

1.2 方 法

1) 种子发芽前预处理。所用种子均用98%硫酸浸泡30 min，然后用大量清水冲洗干净，再用35 ℃温水浸泡9 h，最后用蒸馏水冲洗2～3次，备用。

2) 发芽温。试验设15 ℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃黑暗恒温条件培养，用3层滤纸做发芽床，pH值为6.5～7.5，每个处理100粒种子，4次重复，下同。

3) 不同发芽床试验。选用最佳的发芽温度进行不同发芽床试验，根据发芽率确定最佳发芽床。发芽床设纸上(TP)、褶纸间(PP)、砂上(TS)和砂中(S)4种(纸为种子发芽专用发芽纸，pH值为6.0～7.5；砂子直径0.05～0.8 mm，洗净后160 ℃消毒2 h，无菌水拌成湿砂使用，手捏成团，放手即散开为宜)。试验中数次加水保持湿润，每天记录发芽种子数。纸上是在培养皿中铺3层湿润的发芽纸后置种；纸间是在培养皿中铺3层褶皱湿润的发芽纸，将种子放置在两侧纸壁上；砂上是在培养皿中铺5 mm厚的湿砂后置种；砂间是在培养皿中铺5 mm的湿砂，置种后再铺1层湿润的细砂。

4) 光照条件试验。选用最佳的发芽温度，设置光照(24 h，2 000 lx)和黑暗2种处理进行甘草种子发芽试验，用3层发芽纸做发芽床，试验中保持发芽纸湿润，每天记录种子发芽数。

表1 不同温度处理甘草种子发芽率、发芽势和发芽指数方差分析表

指标 发芽率(%) 发芽指数 发芽势(%) 自由度均方F值P值自由度均方F值P值自由度均方F值P值组间317．232．1820．143312779．7532．280．00036642．4305．690．000组内127．89612395．9571221．729总计151515

注：p<0.01说明差异达到极显著水平，p<0.05说明差异达到显著水平，下同。

5) 发芽动态测定和发芽计数时间。根据适宜发芽条件下的发芽情况，以每天种子发芽数测定甘草种子发芽动态，确定初次和末次计数时间。以达到50%发芽率的天数为初次计数时间，以无种子萌发的天数为末次计数时间。

6) 发芽指标统计[9]。甘草种子的新鲜胚根伸出超过种子长度视为发芽，每天记录萌发种子数至无萌发种子出现为止。各指标计算公式如下：

发芽率(%)=n/N×100%(n为最终正常发芽的粒数；N为供试种子数)；

发芽势(%)=nX/N×100%(nX为发芽初期规定日期内发芽种子数；N为供试种子数)；

发芽指数=∑(Gt/Dt)(式中：Gt为相应各日的正常发芽数；Dt为置床之日算起的日数)。

2 结果与分析

2.1 甘草种子适宜发芽温度的确定

纸上黑暗条件下，甘草种子在不同温度下发芽，对发芽率、发芽指数和发芽势进行方差分析，结果(表1)表明，不同温度处理甘草种子的发芽率无显著差异(p>0.05)，但发芽指数和发芽势均有极显著差异(p<0.01)。对发芽指数和发芽势进行多重比较，进而了解各温度处理间的具体差异情况，结果(表2)显示，较高温度(30 ℃)和较低温度(15 ℃)的发芽势和发芽指数均有极显著差异，发芽指数各处理排序为30 ℃>25 ℃>20 ℃>15 ℃，30 ℃和25 ℃处理无显著差异，说明在较高温度下甘草种子的活力较高。30 ℃、25 ℃和20 ℃处理的发芽势无显著差异，但均显著高于15 ℃，说明较低温度可以影响甘草种子发芽的整齐度，不利于甘草种子发芽。不同温度处理甘草种子发芽率无显著差异，20 ℃和25 ℃发芽率最高为96.5%，30 ℃最低为92.3%。不同温度下甘草种子的发芽动态如图1所示，在较高温度下置床(25 ℃和30 ℃)，第1天的种子发芽率达59.25%和78.25%，第3天时达最高发芽率96.5%和92.3%，15 ℃处理下种子发芽率与其它处理无显著差异，但种子发芽速度十分缓慢，直到第8天才能结束发芽。综合考虑发芽率、发芽势和发芽指数3个指标，甘草种子最适宜的发芽温度为25 ℃。

表2 不同温度对甘草种子发芽的影响

温度(℃)发芽率(%)发芽指数发芽势(%)1594．0±0．41aA108．87±4．06cC7．5±1．76bB2096．5±1．32aA188．75±8．69bB86．5±2．78aA2596．5±0．96aA221．31±13．84aAB91．0±1．68aA3092．3±2．25aA235．06±10．60aA89．25±2．84aA

注：Duncan’s多重比较，小写字母表示p<0.05，大写字母表示p<0.01。下同。

图1 不同温度处理甘草种子发芽率

2.2 甘草种子适宜发芽床的确定

甘草种子在25 ℃和黑暗的适宜条件下进行不同发芽床研究，发芽指标的方差分析结果(表3)表明，不同发芽床对甘草种子的发芽率无显著影响(p>0.05)，对发芽指数和发芽势有极显著影响(p<0.01)。Duncan多重比较结果(表4)表明，纸上、纸间和砂上的发芽势无显著差异(p>0.05)，但是砂上的发芽指数极显著(p<0.01)低于纸上和纸间处理，说明发芽床对甘草种子的发芽整齐度无显著影响，但是在保持种子活力方面，纸上和纸间处理优于砂上。砂间处理的发芽势和发芽指数极显著低于其它处理，其原因是砂间的发芽统计只能待子叶破土后，实际上与其它发芽床的统计标准不一致。在种子发芽过程中，发芽率是种子质量的重要指标，砂上的发芽率最高为97.3%，纸间次之，为96.8%，二者无显著差异。发芽势反映了种子发芽的整齐度，纸间略高于砂上，但无显著差异。发芽指数反映了种子的活力，纸间高于砂上，二者存在极显著差异。纸上和纸间的发芽率、发芽势和发芽指数均无显著差异，但纸间的发芽率略高于纸上。综合分析，甘草种子最适宜的发芽床为纸间。

表5 光照和黑暗处理甘草种子发芽率、发芽势和发芽指数方差分析表

指标 发芽率(%) 发芽指数 发芽势(%) 自由度均方F值P值自由度均方F值P值自由度均方F值P值组间16．1251．960．21111096．295．150．0641326．5080．043组内63．136213．03364．92总计777

表3 不同发芽床甘草种子发芽率、发芽势和发芽指数方差分析表

指标 发芽率(%) 发芽指数 发芽势(%) 自由度均方F值P值自由度均方F值P值自由度均方F值P值组间33．1670．7680．534316004．01160．800．00038667．231770．330．000组内124．131299．527124．896总计151515

表4 发芽床对甘草种子发芽的影响

发芽床发芽率(%)发芽指数发芽势(%)纸上95．5±0．50aA246．6±2．82aA92．0±0．41aA纸间96．8±1．11aA245．9±3．85aA94．0±1．68aA砂上97．3±1．25aA208．7±8．61bB93．3±1．38aA砂间95．5±1．04aA112．3±1．60cC0．0±0．00bB

2.3 甘草种子发芽光照条件的确定

在25 ℃和纸上的适宜条件下进行甘草种子发芽光照试验，对光照和黑暗处理的甘草种子发芽结果进行方差分析(表5)和Duncan多重比较分析(表6)，结果表明，光照处理后甘草种子的发芽率和发芽指数无显著差异(p>0.05)，黑暗处理的发芽势显著高于光照条件(p<0.05)，在种子检验时考虑到下一步的幼苗鉴定，可直接在光照条件下发芽。

表6 光照对甘草种子发芽的影响

光处理发芽率(%)发芽指数发芽势(%)光照98．5aA160．6aA85．5bA黑暗98．3aA162．8aA87．3aA

2.4 发芽动态测定与发芽计数时间

草种子经98%的硫酸处理30 min，再用35 ℃温水浸泡9 h后，在25 ℃和纸间黑暗的适宜条件下进行甘草种子发芽动态研究，结果如图2所示，置床第1天甘草种子萌发率达40%以上，第2天萌发率已超过90%，至第4天时已无新种子萌发。因此，可选择第2天进行初次计数。对每天的发芽率进行多重比较，结果(表7)表明，第2天与第3、4天的发芽率无显著差异，但是第3天和第4天的发芽率较第2天明显高，考虑种子质量的差异，第3天进行末次计数，并作为发芽率的统计时间和结束试验。

图2 甘草种子发芽动态

表7 甘草种子每天发芽率统计

时间(d)发芽率(%)143．8±7．12bB293．25±1．38aA397．0±1．29aA497．3±1．25aA597．3±1．25aA697．3±1．25aA797．3±1．25aA897．3±1．25aA

3 结论与讨论

甘草种子具有豆科植物种子的特性，种皮致密，不易透水透气，呈现较高的硬实休眠现象，严重阻碍种子的发芽，进而影响生产。因此，打破种皮物理休眠成了科研者的关注点。打破种皮休眠常用的方法有温度处理、机械处理和激素处理等，但是处理效果、测定指标及其时间差异较大。葛淑俊等研究了硫酸浸种、微波和超声波处理对乌拉尔甘草种子发芽率的影响，认为以98%硫酸处理30 min效果最好，其7 d的发芽率为82%左右[5]。张余鹏研究了3种不同处理(温水浸泡、机械碾压和98%硫酸处理)后乌拉尔甘草种子的发芽率、发芽势(第3天)和发芽指数，结果表明，98%的硫酸浸泡60 min处理效果最好，发芽率在90%以上，发芽势在30%～40%之间，发芽指数在40～50之间[6]。于娟等研究了硫酸浸种、热水浸种和机械打磨对甘草种子前处理的影响，结果表明，98%的硫酸浸泡60 min，清水浸泡2 h播种后甘草种子发芽率高达90%，效果最好[7]。肉孜完古力等进行了不同处理的甘草种子发芽试验，结果表明，以98%硫酸浸种60 min效果最好，发芽率、发芽势和发芽指数分别为81%、68.3%和10.13，发芽势测定时间为5 d，发芽率测定时间为8 d[8]。以上研究结果均表明，98%的硫酸破除甘草种皮休眠效果最佳，然而，硫酸处理会对种子造成一定程度的伤害，时间越长种子受害越严重，时间太短无法打破硬实。现有研究显示，甘草种子发芽率最高为90%左右，但是发芽时间相对偏长，多为7～8 d。本研究将硫酸处理和温水浸种有机的结合在一起，即用98%硫酸处理30 min，再用35 ℃温水浸泡9 h后，发芽率高达98.5%，在最适宜条件下，第2天的发芽率就可达90%以上，最高发芽率可达98.5%，3 d即可结束试验，明显缩短了发芽时间，提高了发芽率。

不同发芽温度甘草种子的发芽率无显著差异，但是较高温度下甘草种子表现出较高的活力，且种子发芽整齐度也较低温一致，说明较高温度能够提高甘草种子的发芽速度，其可能原因是高温有利于种子吸胀吸水和种子内部酶的活化，进而促进种子萌发。较高温度下种子的发芽速度较快，但是30 ℃处理下种子最高发芽率较20 ℃和25 ℃略低，其可能原因是当温度达到30 ℃时易引起霉菌污染，对种子发芽有一定程度的影响。因此，甘草种子的适宜发芽温度为25 ℃。于福来等研究认为，甘草种子的发芽温度为25 ℃[10]；马海鸽等研究表明，甘草种子萌发的适宜温度为20～30 ℃[11]。二者结论均与本研究结论一致。

不同发芽床对甘草种子的发芽率无显著影响，除砂间处理统计指标不一致外，对甘草种子的发芽势也无显著影响，但是发芽指数纸床明显高于砂床，说明纸床在保持甘草种子活力方面较好，其具体原因待进一步研究。于福来等研究结果显示，砂床发芽表现最差，最终选择纸床为发芽床[10]。本研究也认为，纸床较利于甘草种子发芽，而纸床中的纸间发芽率略高于纸上，因此选择纸间为甘草种子的发芽床。

光照和黑暗处理对硫酸处理过的甘草种子的发芽率和发芽指数无显著影响，这与马海鸽等[11]研究结果一致，但是黑暗处理的发芽势显著高于光照处理说明黑暗处理有利于保持甘草种子发芽的整齐度，考虑到后期幼苗的生长，可在种子发芽后再给予一定时间的光照。

综合考虑影响甘草种子发芽的各因素认为，98%硫酸处理30 min+35 ℃温水浸泡9 h，在纸间25 ℃黑暗培养，是甘草种子萌发条件的最适宜组合，且在第2天初次计数，第3天末次计数并统计发芽率、结束试验。本方法简单易行，可控，较前期文献报道的发芽率高，发芽速度快，是一种高效的标准化发芽程序。

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