MicroRNA-21在心血管疾病中的研究

杨文钢 薛松

综 述

MicroRNA-21在心血管疾病中的研究

杨文钢 薛松

MicroRNA-21； 心血管疾病

MicroRNAs（miRNAs）是一类高度保守的 18～22个碱基长度的非编码小RNA；它们通过诱导转录抑制或转录降解对基因表达进行负调控[1]。最初人们只认识到RNA聚合酶Ⅲ是驱动miRNAs转录的主要因素；然而部分前体长链miRNA（pri-miRNA）转录子长达数千个碱基对，包含4个或更多的尿嘧啶，这会导致聚合酶Ⅲ转录介导作用的终止[2]。MiRNA-21是第一个被确认由RNA聚合酶Ⅱ调控转录的miRNA，这已被确认为miRNAs转录的主要驱动方式。在过去几年里，对很多miRNAs包括miR-21的生物学功能进行了研究[3,4]。MiR-21由单一的基因编码，在众多的脊椎动物物种基因表型中表现出极强的进化保护性。人类miR-21基因定位于染色体17q23.2，它与蛋白质编码基因vmp1（或tmem49）重叠在一个位点。然而，包含miR-21的初级转录物（即pri-mir-21）是从一个保守的启动子开始独立转录的，这个启动子位于重叠的蛋白编码基因的内含子中[5,6]。MiR-21在哺乳动物的器官如心脏、脾脏、小肠和结肠都有表达[7]。有关肿瘤学研究中，miR-21表现出诸多的生物学作用[4,5]，miR-21在许多肿瘤组织标本中都有高表达；最近对miR-21的许多功能研究揭示，miR-21具有致癌活性。同时，miR-21在心血管疾病中的生物学作用已得到广泛的关注[8]。MiR-21在所有主要类型的心血管细胞包括血管平滑肌细胞（VSMC）、内皮细胞、心肌细胞和心脏成纤维细胞[9]中都有稳定的高表达；在许多心血管疾病中，miR-21出现异常表达[8]；并且已经发现miR-21在心血管疾病的发生发展中，是通过其功能的丧失或者功能的增强发挥重要作用的。此外，参与影响心血管效应的miR-21介导的靶基因已经被确认。本文总结了miR-21在心血管疾病中的研究进展。

1 MicroRNA-21与发育

卵子受精后，胚胎发育需要依赖于母体mRNAs转录，直到自身的转录机制起作用为止；从胚胎基因组被激活开始，母体mRNAs降解。MiRNAs在胚胎早期发育阶段的表达在母体mRNAs的降解过程中起了重要作用[10]。在对斑马鱼的研究中发现，在胚胎发育的早期阶段就检测到miR-21的表达。陈及其同事在斑马鱼的早期胚胎组织来源成纤维细胞中检测到miR-21的表达，并且占成纤维细胞中所有miRNAs的40%之多[11]。在另一项对虹鳟胚胎发育的研究中，发现miR-21和STAT3的高表达水平。STAT3是调控miR-21的一个转录因子，具有显著提高胚胎基因的激活作用[12]。MiR-21可能通过未知的机制在母系遗传基因的mRNAs降解中发挥重要作用。

2 MicroRNA-21与心肌缺血损伤

心肌梗死是导致衰弱和死亡的最常见原因之一。心肌梗死中心肌组织的损伤属于心肌组织的缺血事件，组织损伤主要由其缺血持续时间决定，随后再由心肌再灌注损伤引起心肌的再损伤。在缺血过程中，由于无氧呼吸和乳酸积累，细胞内的ATP水平下降，细胞内的pH值降低。反过来又导致Na+/K+-ATP酶功能障碍和随之而来的细胞内钠积聚，导致Na+/Ca2+逆向反转、胞浆和线粒体钙含量增加。虽然在缺血再灌注初始阶段，缺血心肌组织得到再灌注，氧的水平也再恢复；但是，呼吸链反应复合物还处在衰减状态，并有大量活性氧出现。所有这些不良事件导致细胞线粒体通透性加大，线粒体崩解，导致细胞死亡[13]。线粒体不断进行融合和裂变，这也是维持细胞器的保真度所必需的；异常线粒体裂变参与细胞凋亡的发生，这就需要Drp1的参与。Drp1是一种GTP酶，导致线粒体外膜断裂，线粒体小管分裂成碎片[14]。凋亡信号可以介导神经钙蛋白、丝氨酸和苏氨酸蛋白磷酸酶去磷酸化促进凋亡因子，分别导致其激活或失活。近年来，大量的研究已经表明，通过上调或下调的miRNAs改变关键信号元件的表达导致心肌损伤和对心肌进行保护，这些miRNAs成为潜在的治疗靶点[15]。

MiRNA-21在抑制心脏细胞凋亡中起到非常重要的作用，是一个非常好的靶点。MiRNA-21通过调节细胞程序性死亡4和多个心肌保护介质，包括激活蛋白-1的蛋白、内皮型一氧化氮合酶、热休克蛋白70、热休克转录因子-1等起到心肌保护作用[16]。上调miR-21促进细胞生存是通过抑制PTEN（弹力蛋白同源十号染色体缺失的磷酸酶）起作用的。PTEN蛋白可降解3，4，5-三磷酸-磷酸脱脂酶。3，4，5-三磷酸-磷酸脱脂酶由磷脂酰肌醇3激酶构成，在激活产生的促存活AKT激酶通路中起到至关重要的作用。MiRNA-21抑制PTEN在心脏成纤维细胞中的表达增加，而miR-21寡核苷酸抑制它的表达[9]。MiRNA-21也通过PTEN途径控制基质金属蛋白酶-2的表达，说明miRNA-21在治疗心脏衰竭和减轻炎症反应上具有潜在作用。在缺血预适应实验中发现，miRNA-21在缺血损伤区域出现表达下调，而在缺血梗死区的边缘出现miRNA-21的表达上调[16]。Xu等[17]在H9C2细胞中发现miR-21与HSP60和HSP70的转录后抑制相关，实验中也观察到HSP70合成水平的上调[17]。MiRNA-21是Akt效应通路的一个下游因子，通过下调Fas和caspase-8配体的表达介导的抗凋亡作用[18]，并且通过磷脂酶C（PC）促使Akt的磷酸化和通过抑制细胞凋亡来保护心脏。在心脏中，通过miRNA-21抑制PTEN表达与PC激活后PTEN活性的缺失是一致的[19]。

3 MicroRNA-21与心脏保护

在温度升高的条件下，细胞诱导表达出现的蛋白质称为热休克或应激蛋白。这个过程提高了细胞克服进一步损伤的能力。事实上，轻微的热休克已被证实，在延续的缺血再灌注损伤后具有改善心肌存活的作用。热休克蛋白的合成、抗氧化防御系统、增强线粒体的呼吸、线粒体KATP通道开放、抗线粒体通透性转换孔的开放和抑制细胞凋亡被认为是热休克对缺血再灌注损伤的保护机制。而且，注射外源性合成的miRNA-21可减少心肌梗死面积大小的64%[15]。小鼠使用miRNA-21拮抗剂后，由miRNA-21形成的保护作用完全消失。通过基因芯片技术分析确定由miRNAs干预引起多种凋亡相关基因的变化，尤其是在使用miRNA干预后的热休克小鼠，caspase家族成员中1、2、8和14的表达被抑制。除了bnip-3，大部分的促凋亡基因，包括BID（与Bcl-2同源的3域相互作用的死亡受体激动剂）、bcl-10（B 细胞淋巴瘤/白血病 10）、脂肪组织肿瘤（细胞死亡诱导DNA断裂因子，亚基类似效应）、LTBR（淋巴毒素 B 受体）、Trp53（转化相关蛋白53）、Fas（肿瘤坏死因子受体超家族成员）相关基因FasL（Fas配体，肿瘤坏死因子超家族，成员6）等是被抑制的。另一方面，抗凋亡基因bag-3（Bcl-2相关抗凋亡蛋白）和prdx2（过氧化物酶2）是增加的[15]。这些研究结果进一步支持了这一观点，即通过操纵内源性miRNA-21对心血管疾病进行治疗是一个很有前途的治疗方法。

4 MicroRNA-21与心血管疾病

MiRNA-21不仅在癌组织中表达，同样在心血管系统中也有表达。MiRNA-21在癌症的进展中起到了主要作用；但是，其在心血管系统中的功能显得更为复杂。关于miRNA-21在心血管系统中的作用研究表明，miRNA-21在应激小鼠心脏中表达上调，如胸主动脉缩窄导致左心室压力负荷过重或通过去氧肾上腺素（PE）治疗干预的小鼠[20,21]。在miRNA-21对心肌细胞的大小和（或）肥大的影响作用存在不同的观点，程等在利用PE和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激造成心肌细胞应激的模型中抑制miRNA-21的表达，发现心肌细胞显著减小。然而Tatsuguchi等[20]采用反义探针抑制miRNA-21表达，导致乳鼠心肌细胞增多和心肌细胞肥大，miRNA-21的过表达导致心肌细胞略有减小。Thum等[22]在体外和体内使用心肌特异性的miRNA-21反译基因对心肌细胞进行干预，没有发现miRNA-21对心肌细胞大小的直接影响。体外使用H2O2对心脏进行应激实验，发现乳鼠心肌细胞大小对内源性miRNA-21表达上调存在时间和浓度依赖性[23]。Sayed等[24]在miRNA-21调节心肌细胞的出芽和生长方面进行了更进一步的研究，在生长因子存在的条件下，miRNA-21的过表达不影响心肌细胞肥大和生长，但是增加细胞的出芽，表明miRNA-21的表达上调通过重建细胞-细胞间连接或者缝隙连接参与心肌肥厚形成的过程。在受损伤的小鼠和人的心肌中发现miRNA-21表达上调；尤其是在心肌梗死或心脏衰竭后的心脏成纤维细胞中，miRNA-21的表达增加更明显[9,22]。同时，在体内使用miRNA-21抑制剂，miRNA-21的表达水平与心肌纤维化发展呈正相关[22]。缺血再灌注损伤7 d后，小鼠心脏梗死区出现miRNA-21表达增加。利用激光捕获显微切割技术从感兴趣的区域获得的组织样本中，发现在心肌梗死区的心脏成纤维细胞中有miRNA-21高表达，而在正常的心肌组织中却存在低表达[9]。对急性缺血/再灌注的心脏模型进行miRNA-21的表达时空分布观察，在缺血/再灌注后6 h，miRNA-21在梗死边界区高表达，在心肌梗死区表达下调。进一步的体内实验表明，在大鼠心肌梗死面积明显减少时，心脏miRNA-21出现过表达。在体外和体内实验表明，miR-21在接受实验缺氧/复氧损伤和急性心肌梗死后，miRNA-21抑制细胞凋亡率，增强心肌细胞的抗凋亡作用。在未来应用miRNA-21作为靶点治疗心血管疾病时，应考虑到不同时机、细胞特异性和疾病的差异性[25,26]。目前关于miRNA-21在内皮细胞、平滑肌细胞等其他细胞中的作用和功能知之甚少。选择性敲除体外培养的血管平滑肌细胞（VSMC）的miRNA-21，可减少细胞增殖和增加凋亡。在体内使用miRNA-21抑制剂，大鼠颈总动脉损伤后加快损伤细胞的凋亡，同时降低细胞的增殖。这些结果提示，miRNA-21对血管增殖性疾病如动脉粥样硬化、脑卒中的治疗可能同样有效。观察经过氧化氢处理后的血管平滑肌细胞发现，miRNA-21的表达增加。在体外进行miRNA-21的敲除和过表达实验表明miRNA-21介导细胞损伤、细胞凋亡和细胞死亡的保护作用[27]。总之，在心血管系统中miRNA-21的表达和功能的调节是非常复杂的，有待更进一步的研究。

5 展望

MiRNA-21的作用研究已取得重大进展。MiRNA-21与其他大多数miRNAs一样应该有多个靶基因，通过与多种靶mRNA完全或不完全互补配对，调控多种蛋白的表达，从而发挥巨大的生理调控作用。目前发现miRNA-21影响心血管疾病的靶基因主要有程序性死亡基因4（programmed cell death 4，PDCD4）、弹力蛋白同源十号染色体缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homology deleted from chromosome 10，PTEN）、 出 芽 蛋 白 因 子 1（sprouty1，SPRY1） 和出芽蛋白因子 2（sprouty2，SPRY2）这四种。更进一步靶基因的发现有待研究。借助miRNA mimics和antagomirs技术，miRNA-21用于治疗多种心血管疾病有望实现，如治疗心律失常、肥厚性心肌病、心肌纤维化、动脉粥样硬化性心脏病及缺血性心脏病、血管形成后再狭窄等。MiRNA-21的临床前景十分可观。

［1］Ambros V，Lee RC，Lavanway A，et al.MicroRNAs and other tiny endogenous RNAs in C.elegans.Curr Biol，2003，13：807-818.

［2］Kim VN.MicroRNA biogenesis：Coordinated cropping and dicing.Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6：376-385.

［3］Friedman JM，Jones PA.MicroRNAs：critical mediators of differentiation， development and disease.Swiss Medical Weekly，2008，139：466-472.

［4］Krichevsky AM，Gabriely G.MiR-21：a small multi-faceted RNA.J Cell Mol Med，2009，13：39-53.

［5］Selcuklu SD，Donoghue MT，Spillane C.MiR-21 as a key regulator of oncogenic processes.Biochem Soc T，2009，37：918-925.

［6］Fujita S，Ito T，Mizutani T，et al.miR-21 gene expression triggered by AP-1 is sustained through a double-negative feedback mechanism.J Mol Biol，2008，378：492-450.

［7］Lagos-Quintana M，Rauhut R，Yalcin A，et al.Identification of tissuespecific micro-RNAs from mouse.Curr Biol，2002，12：735-739.

［8］Zhang C.MicroRNomics：a newly emerging approach for disease biology.Physiol Genomics，2008，33：139-147.

［9］Roy S，Khanna S，Hussain SR，et al.MicroRNA expression in response to murine myocardial infarction：miR-21 regulates fibroblast metalloprotease-2 via phosphatase and tensin homologue.Cardiovasc Res，2009，82：21-29.

［10］Schier AF.The maternal-zygotic transition：Death and birth of RNAs.Science，2007，316:406-407.

［11］Chen PY，Manninga H，Slanchev K，et al.The developmental miRNA profiles of zebrafish as determined by small RNA cloning.Genes Dev，2005，19：1288-1293.

［12］ Ramachandra RK，Salem M，Gahr S，et al.Cloning and characterization of microRNAs from rainbow trout（oncorhynchus mykiss）：Their expression during early embryonic development.BMC Dev Biol，2008，8：41.

［13］Kung G，Konstantinidis K，Kitsis RN.Programmed necrosis，not apoptosis，in the heart.Circ Res，2011，108：1017-1036.

［14］Tan WQ，Wang JX，Lin ZQ，et al.Novel cardiac apoptotic pathway：the dephosphorylation ofapoptosisrepressorwith caspase recruitment domain by calcineurin. Circulation，2008，118：2268-2276.

［15］Kukreja RC，Yin C，Salloum FN.MicroRNAs:New Players in Cardiac Injury and Protection.Mol Pharmaco，2011，180：558-564.

［16］ Dong S，Cheng Y，Yang J， et al.MicroRNA expression signature and the role of microRNA-21 in the early phase of acute myocardial infarction.J Biol Chem，2009，284：29514-29525.

［17］Xu C，Lu Y，Pan Z，et al.The muscle-specific microRNAs miR-1 and miR-133 produce opposing effects on apoptosis by targeting HSP60，HSP70 and caspase-9 in cardiomyocytes.J Cell Sci，2007，120：3045-3052.

［18］Sayed D，He M，Hong C，et al.MicroRNA-21 is a downstream effector of AKT that mediates its antiapoptotic effects via suppression of Fas ligand.J Biol Chem，2010，285：20281-20290.

［19］ Cai Z， Semenza GL.PTEN activity ismodulated during ischemia and reperfusion：involvement in the induction and decay of preconditioning.Circ Res，2005，97：1351-1359.

［20］Tatsuguchi M，Seok HY，Callis TE，et al.Expression of microRNAs is dynamically regulated during cardiomyocyte hypertrophy.J Mol Cell Cardiol，2007，42：1137-1141.

［21］ Cheng Y，Ji R，Yue J，et al.MicroRNAs are aberrantly expressed in hypertrophic heart：do they play a role in cardiac hypertrophy?Am J Pathol，2007，170：1831-1840.

［22］Thum T，Gross C，Fiedler J，et al.MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts.Nature，2008，456：980-984.

［23］ Cheng Y，Liu X，Zhang S，et al.MicroRNA-21 protects against the H2O2-induced injury on cardiac myocytes via its target gene PDCD4.J Mol Cell Cardiol，2009，47：5-14.

［24］ Sayed D，Rane S，Lypowy J，et al.MicroRNA-21 targets Sprouty2 and promotescellular outgrowths.MolBiolCell，2008，19：3272-3282.

［25］Ikeda S，Pu WT.Expression and function of MicroRNAs in heart disease.Curr Drug Targets，2010，11：913-925.

［26］Montgomery RL， van Rooij E.MicroRNA regulation as a therapeutic strategy for cardiovascular disease.Cur Drug Targets，2010，11：936-942.

［27］ Wickramainghe NS，Manavalan TT，Dougherty SM，et al.Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.Nucleic Acids Res，2009，37：2584-2595.

The study of microRNA-21 in cardiovascular disease

MicroRNA-21； Cardiovascular disease

上海交通大学校基金（项目编号：13XJ10014）

200127 上海市，上海交通大学医学院附属仁济医院心血管外科

薛松，E-mail：xuesong64@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．06．002

R54

A

1672-5301（2016）06-0485-04

2016-01-13）